Información

¿Qué fosforila la proteína tau y qué causa la fosforilación de la tau?

¿Qué fosforila la proteína tau y qué causa la fosforilación de la tau?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Quiero saber qué fosforila la proteína tau y sus 6 isoformas. Sé que las quinasas causan eventos de fosforilación, y en tau puede fosforilarse en una neurona sana en la conformación trans, pero cuando está hiperfosforilada se convierte en la conformación cis de tau.

¿Las quinasas iguales o diferentes causan la fosforilación normal / hiperfosforilación anormal de tau? ¿Se completa con una sola quinasa o múltiples quinasas?

----Editar---

Así que leí mucho de muchos artículos diferentes y descubrí que existen dos tipos de quinasas de amplio espectro clasificadas como: quinasas dirigidas por prolina, como CDK5 y GSK-3beta Quinasas no dirigidas por prolina

Fuente: https://www.hindawi.com/journals/omcl/2015/151979/

Pero leí en este documento: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3601591/

que Cdc2 también puede fosforilar tau

Mi nueva pregunta es un seguimiento de mi pregunta anterior existente, supongo que ¿por qué tau está fosforilada en absoluto? ¿Qué causa la fosforilación de tau en primer lugar? Gracias.


Xu Han y Keping Chen *

Instituto de Ciencias de la Vida, Universidad de Jiangsu, PR China

Recibió: 12 de febrero de 2020 | Publicado: 19 de marzo de 2020

Autor correspondiente: Keping Chen, Instituto de Ciencias de la Vida, Universidad de Jiangsu, 301 Xuefu Road, Zhenjiang 212013, PR China

Abstracto

La fosforilación de proteínas es una modificación postraduccional reversible que involucra una serie de quinasas específicas de secuencia y ocurre en residuos específicos como serina, treonina y tirosina. La fosforilación reversible de proteínas regula casi todos los aspectos del ciclo de vida de la célula y la fosforilación anormal es la causa o consecuencia de muchas enfermedades. Los estados de fosforilación de proteínas pueden mediar en la formación de complejos de proteínas y regular la función de las proteínas, lo cual es importante para la fisiología celular pero también puede promover eventos neuropáticos. La proteína tau es una proteína muy importante asociada a los microtúbulos en el cerebro, que se encuentra con mayor frecuencia en las neuronas y las células gliales. Su nivel de fosforilación está asociado con una variedad de enfermedades del sistema nervioso central como la enfermedad de Alzheimer. En circunstancias normales, la fosforilación de tau postranscripcional conduce a la estabilidad de los microtúbulos. Sin embargo, la hiperfosforilación puede conducir a la deformación y agregación de varios tipos de componentes citoesqueléticos del tejido nervioso, lo que hace que pierdan su función normal.

Palabras clave: Fosforilación de la proteína Tau Enfermedad de Alzheimer Estructura de la tubulina Efectos de los fármacos

Abreviaturas: MAPS: proteínas asociadas a microtúbulos AD: enfermedad de Alzheimer MTRS: transporte mercúrico SER: serina THR: treonina MT: microtúbulos GSK3β: glucógeno sintasa quinasa 3β ALA: alanina PD: dominio de proyección MBD: dominio de unión a microtúbulos PSP: parálisis supranuclear progresiva MAP1B: Proteína asociada 1B GSK3: Glucógeno sintasa quinasa 3 CDK5: Quinasas dependientes de ciclina 5 NFTs: Enredos neurofibrilares PHFs: Filamentos helicoidales emparejados SFs: Filamentos rectos FTLD: Degeneración lobar frontotemporal CJD: Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob Dependiente de PDPK: Dependencia de proteína-prolina -Proteasome System PHF: Par de filamentos helicoidales PTPs: Proteína Tirosina Fosfatasas PSPs: Proteínas Serina / Treonina Fosfatasas PP1: Tipos de Fosfatasa 1 PsP2A: Tipos de Fosfatasa2A PP2B: Tipos de Fosfatasa2B PP2C: Tipos de Fosfatasa Hipopótasa Cronofasa PP: Cronofasa de Proteínas Transferencia de energía de resonancia PKA: proteína quinasas A

Introducción

Las proteínas celulares que se unen a los microtúbulos se denominan colectivamente proteínas asociadas a los microtúbulos (MAP). En circunstancias normales, los MAP son componentes esenciales para mantener la estructura y función de los microtúbulos. Pueden aumentar la estabilidad de los microtúbulos, promover el ensamblaje de los microtúbulos y regular la relación entre los microtúbulos y otros componentes celulares [1]. Los MAP contienen dos regiones funcionales: un dominio de unión alcalino que se une al lado del microtúbulo y un dominio de unión ácido saliente que es una estructura filamentosa que sobresale hacia afuera en forma de un puente horizontal que conecta el MAP a otros componentes celulares, componentes del citoesqueleto, membranas y otras estructuras. Los MAP tienen actividad de unión a microtúbulos y su función se puede realizar regulando la fosforilación y desfosforilación de aminoácidos específicos. Se han descubierto una variedad de funciones de los MAP que implican la regulación de la dinámica citoesquelética de los microtúbulos. Los MAP están presentes en el tejido nervioso durante el desarrollo neuronal y desempeñan un papel indispensable en la remodelación de los microtúbulos durante la actividad neuronal y en la estabilidad de los microtúbulos durante el mantenimiento neuronal. Como resultado, las mutaciones en MAP conducen a trastornos del desarrollo neurológico, trastornos psiquiátricos y enfermedades neurodegenerativas.

Los MAP están regulados postraduccionalmente por fosforilación, que puede afectar la afinidad de los microtúbulos, la localización celular o la función general de los MAP específicos con un efecto profundo en la salud neuronal. La actividad de unión a microtúbulos de un MAP está regulada por la fosforilación y desfosforilación de aminoácidos específicos. La familia MAP incluye principalmente MAP1, MAP2, tau y MAP4. Los tres primeros se encuentran principalmente en neuronas, mientras que MAP4 existe en todo tipo de células. De estos cuatro MAP, el papel de la fosforilación y desfosforilación de la proteína tau en la enfermedad de Alzheimer (EA) es el más estudiado y se ha logrado un progreso significativo. La función de la proteína tau asociada a los microtúbulos es promover el ensamblaje y la estabilización de los microtúbulos en las neuronas, lo cual es necesario para el transporte axonal y el crecimiento de neuritas [2]. Tau es una fosfoproteína asociada a microtúbulos que abunda en neuronas y está regulada por proteína quinasas y proteína fosfatasas. Tau apropiadamente fosforilada se une a los microtúbulos, estimulando así el ensamblaje de tubulina en microtúbulos y manteniendo la estabilidad de los microtúbulos [3]. En el cerebro de la enfermedad de Alzheimer, la tau está hiperfosforilada anormalmente y contiene de tres a cuatro veces más fosfato que la tau normal [4]. In vitro e in vivo, se ha demostrado que la hiperfosforilación de tau reduce la afinidad de la tau por los microtúbulos, lo que conduce a la interrupción del citoesqueleto neuronal y del transporte axonal [5]. La agregación anormal de la proteína tau hiperfosforilada es una característica patológica común de los trastornos del neurodesarrollo comúnmente denominados tauopatía, incluida la EA, la parálisis supranuclear progresiva y la demencia frontotemporal [6]. Varias enfermedades neurodegenerativas, denominadas colectivamente tauopatía, se caracterizan por una tau insoluble y altamente fosforilada que es una inclusión neuronal de filamentos helicoidales rectos o pareados [7].

Microtúbulos y los efectos de la fosforilación de Tau en la estructura de los microtúbulos

El desarrollo y la función neuronales están influenciados por la infraestructura citoesquelética de las células, a saber, microtúbulos, actina y redes de filamentos intermedios. Las redes citoesqueléticas de microtúbulos están organizadas en matrices estables y dinámicas que proporcionan soporte estructural como trayectorias de movimiento molecular y sirven como plataformas de señales durante el desarrollo neuronal y la plasticidad [8-10]. Los microtúbulos están compuestos por heterodímeros de alfa y beta tubulina que se ensamblan en protofilamentos y luego se contactan lateralmente entre sí para formar túbulos [11]. La β-tubulina debe estar en un estado unido a GTP para permitir el ensamblaje de heterodímeros en el protofilamento. La alfa-tubulina se une a la β-tubulina, pero solo la β-tubulina puede hidrolizar el GTP. Una vez que se ensambla el protofilamento, la β-tubulina se expone en el "extremo positivo" y la alfa-tubulina se expone en el "extremo negativo". Esta polaridad estructural conduce a una diferencia en la tasa de crecimiento en cada extremo y se ha observado que la limitación de los extremos ocurre con más frecuencia [12] y es mucho más rápida en el extremo positivo que en el extremo negativo. Los microtúbulos se pueden modificar dentro de las células cambiando entre estados ensamblados y desensamblados en un proceso llamado inestabilidad dinámica [13]. Los MAP tienen la capacidad de unirse a redes de microtúbulos, heterodímeros de tubulina o ambos. Por lo tanto, pueden regular la cinética de ensamblaje / desensamblaje de los microtúbulos para organizar y remodelar adecuadamente la estructura citoesquelética de los microtúbulos durante el desarrollo y la actividad neuronal [14, 15].

Los heterodímeros de α y β-tubulina que se ensamblan en microtúbulos existen en un estado de equilibrio dinámico con la tubulina no polimérica. La estructura filamentosa de los microtúbulos forma citoesqueletos intracelulares en una variedad de células, pero están particularmente enriquecidos en neuronas [16-18]. La dinámica del ensamblaje de los microtúbulos puede regularse mediante la temperatura, las modificaciones de las proteínas de los microtúbulos, las moléculas pequeñas como el paclitaxel y algunas proteínas que interactúan con el transporte de mercurio (MerT) [19-21]. Dado que los microtúbulos desempeñan un papel importante en una amplia gama de funciones biológicas, incluida la formación estructural de neuronas y el transporte de sustancias intracelulares, se especula que la alteración de los microtúbulos (si la hay) puede influir profundamente en la estructura y función neuronal [22-24]. La proteína Tau se ha identificado como un factor que promueve el ensamblaje y la estabilidad de los microtúbulos. Se cree que el ensamblaje de microtúbulos está regulado negativamente por la fosforilación de la proteína tau. Se han identificado más de 40 residuos de serina (Ser) y treonina (Thr) como posibles sitios de fosforilación en la proteína tau. Aunque el significado biológico de cada sitio de fosforilación no está claro, se sabe que la fosforilación de tau en Ser-262 de tau (en la proteína tau de 441 residuos) tiene una profunda influencia en su interacción con los microtúbulos [25].

Efecto de la fosforilación de Tau sobre la estructura de la treonina 231

La secuencia de aminoácidos que interactúa con MT en Tau se localiza en una región rica en prolina y un dominio repetido. Tau contiene 85 sitios potenciales de fosforilación, de los cuales tres sitios S214, T231 y S262 son críticos para la interacción Tau-MT. En tau, tanto los sitios no cebados como los cebados son fosforilados por GSK3β, siendo Thr231 el epítopo cebador más notable [26]. Aunque la fosforilación de S262 redujo fuertemente la afinidad por MT [27], la fosforilación de S214 [28] y T231 [29] redujo principalmente las MT de polimerización de Tau. Habilidad [30] La fosforilación de T231 no solo regula la unión de MT, sino que también es importante para el papel de Tau en la enfermedad [31] porque separa tau de MTS, que puede interactuar con otra célula asociada [32]. Varias quinasas pueden fosforilar Tau en T231, incluida la glucógeno sintasa quinasa 3β (GSK3β), una de las quinasas más importantes implicadas en los procesos patológicos [33]. Después del inicio de la fosforilación en S235, GSK3β fosforila T231 de manera más eficiente [34], aunque este inicio de la fosforilación no es necesario [33]. Los depósitos de Tau aislados de pacientes con enfermedad de Alzheimer contienen típicamente T231 y S235 fosforilados, así como S237 y S238 fosforilados [35]. Además, el sitio no cebado en tau fosforilado de GSK3β-R96A era más potente que el GSK3β de tipo salvaje, lo que indica claramente la importancia de la fosforilación del sitio de cebado en la regulación de las interacciones tau-microtúbulos [36]. Tras este estudio preliminar, se demostró que la fosforilación de tau de Thr231 inducida por GSK3β desempeña un papel clave en la reducción de la unión de tau y la estabilización de microtúbulos [37]. En las células transfectadas, tau con Thr231 mutado a Ala todavía era capaz de unirse eficazmente a los microtúbulos después de la fosforilación con GSK3β [37]. Estos estudios muestran claramente que aunque GSK3β fosforila muchos sitios en tau, no todos los sitios tienen un efecto sobre la función de tau.

Estructura y fosforilación de la proteína Tau

Figura 1: Diferentes isómeros de tau formados por empalme alternativo de ARNm en el cerebro adulto normal. La proteína tau consta de dos grandes regiones: el dominio de proyección (PD) y el dominio de unión a microtúbulos (MBD). Los seis isómeros únicos se diferencian principalmente por el número de secuencias de inserción N-terminales (0N, 1N o 2N) y el número de repeticiones de unión de microtúbulos (3R o 4R) que contienen. En el cerebro adulto normal, la proporción de isómeros 3R a 4R es de aproximadamente 1: 1.

La proteína tau se identificó en 1975 como una proteína con la capacidad de inducir la formación de microtúbulos [38, 39]. Es la MAP que se presenta con mayor frecuencia en el cerebro normal y su función principal es unir la tubulina y promover su polimerización en microtúbulos [39]. También se combina con microtúbulos completamente formados para mantener su estabilidad [40], reducir la disociación de las moléculas de tubulina e inducir la formación de haces de microtúbulos. El gen tau se encuentra en el brazo largo del cromosoma 17 y tiene 79 sitios de fosforilación que pueden ser modificados por las proteínas quinasas de serina / treonina [38]. De hecho, la polimerización y estabilización de los microtúbulos está determinada principalmente por el estado de fosforilación de tau. La fosforilación de tau se puede dividir en dos tipos dependiendo de si el residuo modificado está fosforilado por una quinasa dirigida por prolina o por una quinasa no dirigida por prolina. A lo largo del curso patológico de muchas enfermedades neurodegenerativas, la proteína tau es fosforilada principalmente (pero no únicamente) por las proteínas quinasas dirigidas por prolina. En el sistema nervioso central de un ser humano sano, el corte y empalme alternativo del ARNm de tau da como resultado seis isoformas diferentes de la proteína tau entre 352 y 441 aminoácidos de longitud con pesos moleculares de 48 a 67 kDa (Figura 1) [41-43]. La proteína tau se subdivide en cuatro regiones: la región ácida en la porción N-terminal, la región rica en prolina, el dominio de unión a microtúbulos y la región C-terminal. De los 85 sitios de fosforilación putativos en la proteína tau, 45 sitios son serinas, 35 son treoninas y 5 son tirosinas [44-46].

La fosforilación de serina en el motivo KXGS del dominio de unión a microtúbulos reduce la afinidad de tau por los microtúbulos y, por lo tanto, evita su unión [47-49]. La cantidad de proteína tau fosforilada en sitios ricos en prolina como Thr-181, Ser-199 y Thr-231 es mayor en el cerebro de los pacientes con EA y, por lo tanto, estas tres formas fosforiladas de tau pueden usarse como biomarcadores para EA [50-52 ]. El análisis cinético mostró que la pseudofosforilación aumentó la tasa de agregación de tau al aumentar la tasa de nucleación del filamento. Además, aumenta la tendencia a la agregación estabilizando los filamentos maduros para evitar la despolimerización. El fosfato unido covalentemente se distribuye dentro del dominio de unión a microtúbulos de tau y adyacente a aproximadamente 40 sitios [45,53,54]. La ocupación de estos sitios puede afectar la agregación de tau de dos maneras. Primero, la ocupación de ciertos loci regula la afinidad de tau-tubulina [55], promoviendo un aumento en el nivel de tau citoplásmico libre disponible para la nucleación y apoyando las reacciones de agregación [56-59]. En segundo lugar, la hiperfosforilación aumenta directamente la tendencia a la agregación de tau [60,61]. Además, se ha informado que la fosforilación de tau reduce la conversión de tau mediada por proteasomas en modelos de células neuronales [62]. Por tanto, la ocupación de ciertos sitios de fosforilación de tau puede aumentar la concentración de tau citoplásmica libre mediante una variedad de mecanismos.

Fosforilación de Tau y enfermedades neurológicas

Las enfermedades neurodegenerativas con abundantes cuerpos de inclusión de proteína tau filamentosa se denominan tauopatías. Algunas enfermedades neurodegenerativas se diferencian de la EA en que carecen de la patología de las placas beta-amiloides [63]. Sin embargo, las tauopatías distintas de la EA incluyen la enfermedad de Parkinson ligada al cromosoma 17 con demencia frontotemporal, encefalopatía traumática crónica, argicophilia granulosus, parálisis supranuclear progresiva (PSP), degeneración corticobasal, tauopatía de la glía globular y enfermedad de Pick. Debido a la acumulación anormal de proteína tau fosforilada en las células neuronales y gliales en estas enfermedades neurodegenerativas, la plasticidad sináptica de las neuronas del hipocampo puede verse afectada y la función de la memoria puede verse seriamente alterada [64]. Se ha informado que los cambios en la fosforilación de proteínas afectan el transporte axonal en modelos de enfermedades neurodegenerativas. Por ejemplo, un estudio mostró que a medida que aumentaba la fosforilación de las proteínas del neurofilamento y la proteína MAP1B asociada a los microtúbulos, disminuían sus respectivas tasas de transporte axonal [65].

Por el contrario, otro estudio reveló que el nivel mejorado de fosforilación de tau aumentó la velocidad lenta general del transporte de la proteína tau en las neuronas y que la inhibición de la fosforilación de tau por GSK-3 disminuyó su motilidad (Figura 2). Debido a estos y otros hallazgos similares, los defectos del transporte axonal se han considerado uno de los factores que contribuyen a la enfermedad neurodegenerativa [66]. (Figura 2) Tau y otras proteínas asociadas a microtúbulos son fosforiladas por la glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK-3), así como las quinasas dependientes de ciclina (como CDK5) y la subunidad activadora p25, para formar proteínas tau altamente fosforiladas. Esta forma altamente fosforilada de la proteína luego se disocia en filamentos helicoidales que eventualmente forman ovillos neurofibrilares (NFT). La EA es reconocida como la principal causa de demencia y se estima que afecta a 47 millones de personas en todo el mundo [67]. La enfermedad se caracteriza principalmente por deterioros progresivos cognitivos y de la memoria. Las características neuropatológicas de la EA son (1) muerte celular extensa, (2) depósitos extracelulares de placas β-amiloides (que causan nefritis) y (3) agregación sináptica de proteína tau hiperfosforilada también conocida como ovillos neurofibrilares (NFT) [68]. El análisis de la estructura cristalina de los filamentos de tau en cerebros con EA por Fitzpatrick et al. en 2017 mostró que estas inclusiones patológicas de tau consisten en filamentos helicoidales emparejados (PHF) y filamentos rectos (SF) [69-71].

Figura 2: Tau y otras proteínas asociadas a microtúbulos son fosforiladas por la glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK-3), así como por las quinasas dependientes de ciclina (como CDK5) y la subunidad activadora p25, para formar proteínas tau altamente fosforiladas. Esta forma altamente fosforilada de la proteína luego se disocia en filamentos helicoidales que eventualmente forman ovillos neurofibrilares (NFT).

La fosforilación de tau mejora la formación de PHF. La fosforilación también puede ser una forma fisiológicamente factible de llevar tau a un estado propenso a PHF. La fosforilación puede alterar la conformación de tau, haciéndola larga y rígida [72]. La microscopía electrónica con tinción negativa mostró que el núcleo de los PHF y SF está compuesto por una pila de doble hélice de subunidades en forma de C [73] y los pasos sucesivos a lo largo de la hebra β del protofilamento están unidos por simetría helicoidal. Además, la región C-terminal de tau está desordenada y se proyecta lejos del núcleo para formar una capa difusa [74]. Los núcleos de protofilamentos de los PHF y SF son similares, lo que indica que son polimorfos ultraestructurales. El polimorfismo ultraestructural entre PHF y SF se debe a la diferencia en el contacto lateral entre los dos protofilamentos. En el PHF, las dos hebras forman exactamente la misma estructura simétrica en espiral, mientras que en el SF, los protofilamentos son asimétricos. En la EA, tau está altamente fosforilada y muchas de las principales quinasas que fosforilan la proteína tau se dirigen a los sitios de fosforilación de tau de la glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK-3) [75]. Otra de las principales quinasas responsables de la hiperfosforilación de tau es la quinasa 5 dependiente de ciclina (CDK5), un miembro de la familia de quinasas dependientes de ciclina serina / treonina quinasa.

La mayoría de las neuronas de la EA no tienen una estructura de microtúbulos normal, sino que tienen NFT patológicas que son filamentos helicoidales emparejados de tau hiperfosforilada anormal. Dado que se ha demostrado que la patología de tau está asociada con la pérdida neuronal, una de las estrategias de tratamiento dirigidas a la base molecular de la EA incluye la inhibición de la hiperfosforilación de tau [76]. Para examinar si la destrucción de los microtúbulos induce la fosforilación de tau, et al. proteína tau coexpresada con estatmina, una fosfoproteína de 19 kDa que despolimeriza los microtúbulos, en células COS-7. La expresión de estatmina indujo mutaciones de microtúbulos e hiperfosforilación de tau en Thr-181, Ser-202 y Thr-205, lo que indica que la rotura de microtúbulos induce la fosforilación de tau posterior [77]. La degeneración lobar frontotemporal (FTLD) abarca dos síndromes clínicos y tres subtipos clínico-patológicos: los síndromes clínicos son la demencia frontotemporal variante conductual y la afasia progresiva primaria, y los subtipos neuropatológicos se caracterizan por una agregación de proteínas anormal [64]. La PSP es una enfermedad neurodegenerativa rara de inicio tardío cuyos síntomas clínicos incluyen inestabilidad postural temprana, parálisis de la mirada vertical y un inicio tardío de la demencia.

Desde la perspectiva ultraestructural, los filamentos NFT presentes en la PSP son rectos y contienen solo la isoforma 4R de la proteína tau [78]. Los modelos animales han revelado que las mutaciones en el gen tau condujeron a la formación de células granulares de la circunvolución dentada de las fibras musgosas del hipocampo, y la epilepsia primaria está causada parcialmente por mutaciones en el gen de la proteína Tau. La mutación S169L del gen de la presenilina 1 también se ha encontrado en pacientes con ataques epilépticos y enfermedad de Alzheimer familiar [79]. La EA es la causa más común de demencia. Es una enfermedad degenerativa del sistema nervioso central y se caracteriza principalmente por deterioro cognitivo progresivo y deterioro de la memoria. Las principales características patológicas de la EA son las placas seniles y los ovillos neurofibrilares. El componente central de los ovillos neurofibrilares es la fibrilla de doble hélice formada por la proteína Tau anormalmente modificada [80]. La enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) es una enfermedad neurodegenerativa humana rara y mortal que pertenece a la familia de enfermedades conocidas como encefalopatías espongiformes transferibles o enfermedades priónicas. El nivel de líquido cefalorraquídeo en pacientes con ECJ es significativamente más alto que el de los pacientes con EA y otros pacientes con demencia [81] (tabla 1). Como se detalla anteriormente, está claro que la proteína tau está estrechamente asociada con muchas enfermedades del sistema nervioso central y aclarar su mecanismo de acción puede conducir a nuevos objetivos de tratamiento para enfermedades relacionadas con la proteína tau.

Tabla 1: Clasificación y características de las enfermedades causadas por la fosforilación de tau.

La fosforilación afecta el transporte axonal y la degradación de la proteína Tau

La forma fosforilada de MAP tau se acumula en los ovillos neurofibrilares en la enfermedad de Alzheimer. Para investigar el efecto de los residuos de tau fosforilados específicos sobre la función de la proteína, se expresó la proteína tau de tipo salvaje o fosforilada en células cultivadas. Sus resultados mostraron que la fosforilación mejorada de tau disminuyó su unión a microtúbulos y aumentó el número de partículas de tau en movimiento sin afectar la cinética de transporte de axones. Por el contrario, la disminución de la fosforilación de la proteína tau aumentó la cantidad de proteína tau unida a los microtúbulos e inhibió el transporte axonal de tau. Para determinar si la eliminación de la proteína tau dio como resultado un aumento de la tau fosforilada, se inhibió la autofagia en las neuronas. Esto dio como resultado un aumento de 3 veces en la tau fosforilada en comparación con la tau de tipo salvaje y la tau endógena no se vio afectada. En fibroblastos embrionarios de ratón deficientes en autofagia, la degradación proteasomal de la tau fosforilada también se redujo en comparación con la tau de tipo salvaje. Estos hallazgos indican que si bien las vías de la autofagia y del proteasoma están implicadas en la degradación de tau, la autofagia parece ser la vía principal para la eliminación de la tau fosforilada en las neuronas. Por tanto, la autofagia defectuosa puede contribuir a la acumulación patológica de tau fosforilada en enfermedades neurodegenerativas [82].

Las tauopatías se caracterizan por la presencia de proteína tau insoluble. La interacción de tau con microtúbulos se logra principalmente mediante el dominio de unión a microtúbulos ubicado en el C-terminal de tau. Este dominio contiene tres o cuatro repeticiones de unión (dependiendo del corte y empalme alternativo de décimos exones), lo que da como resultado un isómero de proteína tau 3R o 4R, respectivamente. Sin embargo, tau también interactúa con componentes de la membrana plasmática a través de su dominio de proyección N-terminal [83]. Si bien sabemos que la fosforilación de tau reduce su capacidad para unirse y estabilizar microtúbulos, recientemente hemos descubierto que la unión de tau a la membrana plasmática también está regulada por la fosforilación [84]. Es bien sabido que el aumento de la fosforilación de tau reduce su afinidad por los microtúbulos, lo que conduce a la inestabilidad del citoesqueleto neuronal [85]. Se ha demostrado que la fosforilación específicamente en Ser-262, Ser-293, Ser-324 y Ser-356, que son serinas que se encuentran en las secuencias KXGS de los dominios R1, R2, R3 y R4, respectivamente, reducen la unión de tau a los microtúbulos. La fosforilación de tau en regiones ricas en prolina que rodean a Ser-202, Ser-235, Thr-231 y Ser-235 también contribuye a la disociación de tau de los microtúbulos. Sin embargo, la fosforilación en regiones ricas en prolina por sí sola no es suficiente para disociar completamente la tau de los microtúbulos [29]. GSK3β es una proteína clave en la vía de señalización de la insulina que fosforila varios residuos en tau [77,86]. Los sitios de fosforilación de tau más favorables para GSK-3β son Ser-396, Ser-400 y Ser-404 [87].

Se ha informado que la fosforilación de Ser-262 da como resultado una unión de microtúbulos reducida de tau [48,88]. Sin embargo, la fosforilación de Ser-262 indujo sólo alrededor del 40% de la actividad de unión a los microtúbulos [89], lo que indica que la fosforilación en otros sitios es necesaria para inhibir completamente su actividad biológica. Los 21 sitios de fosforilación en PHF-tau se han identificado por reactividad con tecnologías de secuenciación de anticuerpos y proteínas en varios sitios de fosforilación. Entre ellos, 10 sitios están en el motivo Ser / Thr-Pro y 11 están en el motivo no Ser / Thr-Pro [90,91]. Los sitios Ser / Thr-Pro y no Ser / Thr-Pro pueden ser fosforilados por la proteína quinasa dependiente de prolina (PDPK) y no PDPK, respectivamente. En el sitio de fosforilación no dirigido a prolina de PHF-tau, tanto Ser-208 como Ser-210 están en el rango del motivo SR.

Además, además del conocido sitio de fosforilación de GSK-3β en tau, los estudios han identificado un nuevo sitio de fosforilación Thr-175 y un sitio de fosforilación sin prolina Ser-400. TTK es una cinasa Ser / Thr no dirigida por prolina que se ha purificado de cerebro bovino [92]. Es la primera tau quinasa en fosforilar Ser-208 y Ser-210, ambos de los cuales son PHE fosfato. Sitio. Thr-212 es un residuo vecino cercano a Ser-208 en tau y se sabe que es el sitio de fosforilación de GSK-3β [93]. Las pruebas de absorción de los péptidos pS208 y pS210 demostraron la especificidad de anti-pS208. Por lo tanto, podemos confirmar que el sitio de fosforilación Ser-208 es un sitio separado de Thr-212. Además de afectar su transporte, la fosforilación de tau también afecta su capacidad para degradarse [94]. Estudiamos la degradación de tau por el sistema de ubiquitina-proteasoma (UPS) y macroautofagia (autofagia) en el contexto del transporte de tau. Mientras que el UPS elimina las proteínas transitorias marcándolas con cadenas de ubiquitina, la autofagia elimina las proteínas estructurales de larga duración, así como las proteínas dañadas o mal plegadas [95]. También se ha demostrado que la autofagia reduce tanto las proteínas tau de tipo salvaje como las modificadas, incluidas las especies escindidas por caspasa y truncadas en el extremo C [96].

Hiperfosforilación de la proteína tau

La fosforilación aberrante de proteínas puede conducir a procesos relacionados con enfermedades [97]. Por consiguiente, la fosforilación anormal de tau se observa en muchas enfermedades neurodegenerativas. Por ejemplo, las investigaciones histopatológicas de la EA mostraron una acumulación extraneuronal de péptido β-amiloide en placas, agregados neuronales de NFT y astrogliosis alrededor de las neuronas [98]. La hiperfosforilación anormal de tau conduce a agregación, formación de NFT, rotura de microtúbulos, disfunción neuronal y muerte [99]. NFT consta de un par de filamentos helicoidales (PHF), que a su vez consta de una proteína tau asociada a microtúbulos en un estado hiperfosforilado [100]. En la EA, el sistema de fosforilación / desfosforilación parece estar muy afectado [101]. Se ha demostrado que la captación / metabolismo de la glucosa cerebral en la EA está alterada [102] y se ha sugerido que este daño está asociado con una hiperfosforilación anormal de tau. Este hallazgo implica a los astrocitos como un factor clave, especialmente porque los cambios en la captación de glucosa y / o la captación de glutamato (mediada por astrocitos) afectan la función neuronal y la supervivencia.

A través de complejas cascadas de señales, la fosforilación y desfosforilación de proteínas pueden regular la plasticidad neuronal y la neurotransmisión, lo que perjudica el aprendizaje y la memoria. La cascada de señales está controlada con precisión por el proceso dinámico reversible de fosforilación que depende de un equilibrio preciso entre la actividad de la proteína quinasa y la proteína fosfatasa. La secuenciación del genoma humano predice la existencia de más de 500 quinasas y aproximadamente 150 genes de fosfatasa. Las proteínas quinasas se subdividen en dos familias: serina / treonina quinasas con 428 miembros y tirosina quinasas con 90 miembros [103,104]. Las proteínas fosfatasas se clasifican en tres familias diferentes: proteína tirosina fosfatasas (PTP) [105], proteína serina / treonina fosfatasas (PSP) [106] y proteína fosfatasas de especificidad dual (tirosina y serina / treonina). De las fosfatasas conocidas, aproximadamente 107 son PTP y aproximadamente 40 son PSP [107].

Datos recientes muestran que la familia de las enzimas fosfatasa desempeña un papel indispensable en el control de la función neuronal [108]. La proteína serina treonina fosfatasa representa una familia multigénica altamente conservada en evolución [109]. Según la homología de secuencia y las propiedades bioquímicas, las fosfatasas conocidas se pueden dividir en cuatro familias interrelacionadas. Las tres familias de la proteína serina treonina fosfatasa tipos 1, 2A y 2B (PP1, PP2A y PP2B) tienen una homología de secuencia de aminoácidos primaria significativa, respectivamente. Por el contrario, la fosfatasa tipo 2C (PP2C) es más diversa. Entre ellos, PP2A es una proteína fosfatasa que regula la mayor parte de la fosforilación de la proteína tau. Entre las tau fosfatasas identificadas en el cerebro humano, la PP2A representa más del 70% de la desfosforilación de tau [110]. En el cerebro con EA, la actividad de PP2A se redujo significativamente [111]. PP2A es una enzima multimérica que consta de una subunidad catalítica (C) y dos subunidades reguladoras (subunidad A o subunidad B). Se considera que la forma fisiológica de PP2A es una composición heterogénea compuesta por subunidades A y C. Trimer. La principal forma natural de PP2A es un heterotrímero en el que la enzima central se une a una de varias subunidades reguladoras expresadas de una manera específica de células y tejidos [112]. Otra función potencial de PP2A en el cerebro es regular la fosforilación de la proteína asociada a microtúbulos (MAPS).

The activity of protein phosphatase (PP) 2A is downregulated and promotes hyperphosphorylation of tau in the brain of Alzheimer’s disease (AD). Studies have shown that calyculin A, a potent specific protein phosphatase (PP) 2A and PP1 inhibitor, is injected into both sides of the rat hippocampus, thereby replicating Alzheimer’s- like defects in the dephosphorylation system. It was found that rats injected with calyculin A found spatial memory retention damage in the Morris water maze test. At the same time, tau was hyperphosphorylated at the Ser396 / Ser404 (PHF-1) and Ser-262 / Ser-356 (12E8) sites, as determined by immunohistochemistry and Western blotting. This suggests that PP2A is involved in the in vivo regulation of tau phosphorylation and that down-regulation of this phosphatase will result in hyperphosphorylation of tau protein [113]. The hyperphosphorylation of the tau protein and the subsequent formation of NFTs are associated with abnormal activation of protein kinases [114].

In fact, studies have shown that the imbalance of kinase and phosphatase activity may play a causative role in the hyperphosphorylation of tau [102]. The proline-directed protein kinases that catalyze the phosphorylation of tau (such as GSK-3 and CDK5) predominantly do so at Ser-Pro and Thr-Pro sites on the tau protein, whereas the non-proline-directed protein kinases (such as protein kinase A, protein kinase C, calmodulin-dependent kinases, plasmin- dependent kinases, and glucocorticoid-dependent kinases) primarily phosphorylate serine or threonine residues and do not require proline guidance. It has been demonstrated at the cellular, brain, and animal levels that phosphatases play an important role in protein degradation in neurons in diseases such as AD. Studies have reported that inhibiting protein phosphatase activity induced tau hyperphosphorylation and aggregation [115].

Drugs that Affect Tau Phosphorylation Patterns

Nimodipine Attenuates Phosphorylation of Tau at Ser-396: Nimodipine is an L-type calcium channel antagonist that reduces excessive calcium influx in pathological conditions [116] and shows neuroprotective effects. Nimodipine treatment was initially used due to its ability to produce vasodilation in smooth muscle cells lined with blood vessels [117]. Chronic cerebral hypofusion (CCH) has been reported to promote hyperphosphorylation of the tau protein. It showed that nimodipine attenuated CCH-induced tau phosphorylation by up-regulating the expression of miR-132. In addition, nimodipine inhibited CCH-induced activation of GSK-3β and neuronal apoptosis. These findings support the role of nimodipine in inhibiting tau phosphorylation at Ser-396 via miR-132/GSK-3β and points to new potential drug target for the treatment of tauopathy in CCH by regulating the miR-132/GSK3β pathway [116].

Tamoxifen Inhibits CDK5 Kinase Activity and Regulates Tau Phosphorylation: CDK5 is a multifunctional enzyme that plays an important role in brain development. The catalytic subunit of this kinase does not have enzymatic activity as a monomer but is activated by binding to activation subunits p35 or p39. These activation subunits are structurally related to cyclins, activators of cell cycle CDKs, but do not show homology with cyclins at the amino acid level. In contrast to other CDKs, activation of CDK5 does not require phosphorylation of the activation loop. Studies have shown that neurotoxicity induces proteolytic cleavage of the p35 subunit by calcium-regulated calpains [68]. In vitro experiments have shown that this proteolytic conversion of p35 to p25 does not significantly alter the steady-state kinetics of tau phosphorylation by CDK5 [118]. The binding of CDK5 to p25, the N-terminally truncated proteolytic product, stabilizes CDK5 in the active dimer form and alters its substrate specificity.et al.identified tamoxifen from a large-scale bioluminescent resonance energy transfer (BRET)-based screen of small molecules that inhibit the interaction between CDK5 and p25. They showed that tamoxifen reduced tau phosphorylation by blocking the activation of CDK5 by p25 [118]. This finding paves the way for new therapies for tauopathies by harnessing the drug tamoxifen [118].

Rapamycin Reduces Tau Phosphorylation at Ser-214 by Modulating cAMP-Dependent kinases: Mammalian target of rapamycin (mTOR) is a highly evolutionarily conserved serine/threonine kinase. mTOR is involved in regulating many cellular processes such as autophagy, protein translation, ribosome biosynthesis, actin organization, mitochondrial oxygen consumption, proliferation, and differentiation [119]. It is worth noting that mTOR acts as a linker to protein kinase signals, receiving inputs from many upstream signaling pathways and delivering various downstream kinases such as cAMP-dependent protein kinases (e.g. PKA), GSK-3β, and mitogen-activated protein kinases [120]. Since all these kinases are tau-associated kinases, whether rapamycin can modulate tau phosphorylation by regulating these kinases remains to be determined. In human neuroblastoma SH-SY5Y cells, a cell model widely used for tau pathology studies, research indicated that rapamycin reduced the PKA-mediated phosphorylation of tau at Ser-214. Similar results were obtained in wild-type human embryonic kidney 293 (HEK293) cells that were stably transfected with the longest isoform of recombinant human tau (tau441 HEK293/tau441). Since Ser-214 is a site that blocks tau hyperphosphorylation [121], the inhibition of mTOR by rapamycin could indirectly prevent or reduce tau hyperphosphorylation.

Research has focused on rapamycin-induced enhancement of autophagy, as autophagy mediates massive degradation of cytoplasmic content and thus enhances the clearance of hyperphosphorylated tau [122]. It is also thought that rapamycin may inhibit the synthesis of the tau protein. However, since autophagyinduced by rapamycin gives priority to the reduction of excessive phosphorylated and insoluble tau and soluble tau is dispersed throughout the cell, it may not be easy to reduce tau levels by autophagic degradation, and showed that rapamycin improved memory deficits in 6-month-old 3xTg AD mice before accumulation of hyperphosphorylated and insoluble tau was observed [123]. Similarly, another study using an AD mouse model showed that the protective effect of rapamycin was apparent only before insoluble tau accumulated in these animals [124]. These studies suggest that the protective effects of rapamycin may not be limited to autophagic clearance of hyperphosphorylated and insoluble tau.

Conclusión

As a major MAP, tau protein plays an important role in neurodegenerative diseases. AD is pathologically identified by the presence of NFTs containing hyperphosphorylated tau protein. Glycosylation and ubiquitination also play a role in aberrant tau phosphorylation. Investigating the phosphorylation mechanisms of tau protein provides considerable insight into the progress of neurodegenerative diseases and can provide a reasonable basis for early disease treatment. Tubulin is a very unstable protein that easily loses GTP/ GDP exchange efficiency at 37°C without the presence of GTP and protein-stabilizing compounds with multiple hydroxyl groups. Thus, decreased tubulin turnover and/or the reduced expression of factors required for tubulin maintenance may decrease the number of microtubules or tubulin level in normal aging neurons. In addition, in autophagy-deficient mouse embryonic fibroblasts, but not in neurons, proteasomal degradation of phosphorylated tau is reduced compared to wild-type tau.

While autophagy and proteasome pathways are involved in tau degradation, autophagy appears to be the main pathway for the clearance of phosphorylated tau in neurons. The enhancement of autophagy pathways may have potential as a novel therapeutic strategy in AD and other neurodegenerative diseases, along with inhibiting in vivo signaling pathways that form hyperphosphorylated tau and proteins aggregates. Phosphorylation of the tau protein is regulated by inhibiting GSK-3β, CDK5, and activating PP2A acid esterase. In vitro cell culture studies have revealed that aniline, rhodanine, benzylhydrazide, amino pyridine, and other such compounds can inhibit the aggregation of tau. In recent years, a defect in kinase inactivation in old age has been suggested as a potential mechanism linking body temperature regulation and tau protein phosphorylation. This finding could provide a strategy to help the elderly improve their thermoregulatory mechanisms. It may also serve as a potential new AD treatment strategy.

Table Abbreviations

Frontotemporal dementia and tremor paralysis: FTDP-17, Microtubule Associated Protein Tau: MAPT, progressive supranuclear palsy: PSP, Marfan syndrome: MFS, Alzheimer’s disease: AD, Creutzfeldt-Jakob disease: CJD, Colony Stimulating Factor: CSF

Contribuciones de autor

Conceptualization, Xu Han. and Keping Chen. Validation, Keping Chen. Formal Analysis, Xu Han Investigation, Xu Han. Writing – Original Draft Preparation, Xu Han Writing – Review & Editing, Xu Han. Visualization, Xu Han. Supervision, Keping Chen Project Administration, Keping Chen. Funding Acquisition, Keping Chen.

Fondos

This work was supported by the ational Natural Science Foundation of China [No. 31572467].

Acknowledgment

We would like to thank LetPub (www.LetPub.com) for providing linguistic assistance during the preparation of this manuscript.

Conflicts of Interest

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

-->


Introducción

Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative dementia and affects more than 35 million people worldwide. Thus, the development of therapeutic methods is urgently needed to determine the underlying molecular mechanism of AD. Major pathological hallmarks of AD include senile plaques and neurofibrillary tangles (NFT), which consist mainly of amyloid β peptide (Aβ) and hyperphosphorylated tau, respectively (Mattson, 1997 Bettens et al., 2010). Mutations of the amyloid precursor protein (APP) and presenilin, a component of γ-secretase, are found in familial AD, and previous studies have established the hypothesis of the amyloid cascade (Huse and Doms, 2000 Gotz et al., 2004 Hardy, 2006 Bertram et al., 2010). On the basis of this hypothesis, great effort has been paid to develop drugs to reduce Aβ production or to clear Aβ, but successful results have not yet been obtained. In contrast, it has been shown that tau pathology is more closely related to neuronal loss (Gómez-Isla et al., 1997 Ingelsson et al., 2004). Tau is a genetic factor of a neurodegenerative disease known as frontotemporal dementia parkinsonism linked with chromosome 17 (FTDP-17 Hutton et al., 1998 Poorkaj et al., 1998 Spillantini et al., 1998). FTDP-17 tau mutants are highly phosphorylated in patient brains. Regardless of whether phosphorylation is a cause of FTDP-17, it is still critical to determine the neuronal milieu in which tau hyperphosphorylation occurs. Cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) is a major tau kinase that is involved in abnormal phosphorylation in AD brains (Imahori and Uchida, 1997 Cruz and Tsai, 2004 Engmann and Giese, 2009). Here, we summarize the phosphorylation of tau by Cdk5. To the best of our knowledge, this is the first review article focused specifically on Cdk5 phosphorylation of tau.


Abstracto

One of the hallmarks of Alzheimer's disease is the abnormal state of the microtubule-associated protein tau in neurons. It is both highly phosphorylated and aggregated into paired helical filaments, and it is commonly assumed that the hyperphosphorylation of tau causes its detachment from microtubules and promotes its assembly into PHFs. We have studied the relationship between the phosphorylation of tau by several kinases (MARK, PKA, MAPK, GSK3) and its assembly into PHFs. The proline-directed kinases MAPK and GSK3 are known to phosphorylate most Ser-Pro or Thr-Pro motifs in the regions flanking the repeat domain of tau: they induce the reaction with several antibodies diagnostic of Alzheimer PHFs, but this type of phosphorylation has only a weak effect on tau−microtubule interactions and on PHF assembly. By contrast, MARK and PKA phosphorylate several sites within the repeats (notably the KXGS motifs including Ser262, Ser324, and Ser356, plus Ser320) in addition PKA phosphorylates some sites in the flanking domains, notably Ser214. This type of phosphorylation strongly reduces tau's affinity for microtubules, and at the same time inhibits tau's assembly into PHFs. Thus, contrary to expectations, the phosphorylation that detaches tau from microtubules does not prime it for PHF assembly, but rather inhibits it. Likewise, although the phosphorylation sites on Ser-Pro or Thr-Pro motifs are the most prominent ones on Alzheimer PHFs (by antibody labeling), they are only weakly inhibitory to PHF assembly. This implies that the hyperphosphorylation of tau in Alzheimer's disease is not directly responsible for the pathological aggregation into PHFs on the contrary, phosphorylation protects tau against aggregation.

The project was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft.

Autor correspondiente. Tel: +49-40-89982810. Fax: +49-40-89716822. E-mail: [email protected]


Discusión

Due to the controversial role of neurofibrillary tangle (NFT) formation in the neurodegenerative process [2–4, 6–9, 43–47], a better understanding of the mechanisms leading to the formation of NFT would be beneficial to our understanding of AD.

In this report, we have demonstrated that GSK-3β phosphorylation of tau is sufficient to induce the clustering of ARA-induced filaments into structures similar to the NFT-like aggregates of tau filaments purified from AD brain [33, 34]. These results suggest that GSK-3β phosphorylation not only produces a small but significant increase in tau filament formation, but also shows that phosphorylation alters the nature of interactions between those filaments resulting in their clustering into NFT-like structures. Although in this report we address only the effects of tau phosphorylation by GSK-3β, ARA inducer concentration (the inducer:tau ratio in polymerization), and ThS on the clustering of tau filaments into NFT-like structures, we feel that this is an important first step in unraveling the molecular mechanisms of NFT formation through cell-free in vitro modeling.

The clusters of tau filaments formed by polymerization of GSK-3β phosphorylated tau are stable and their formation is readily reproducible, although various factors influence the size, mass and density of the clusters. Here we demonstrate the effects of inducer and the ratio of inducer:tau concentration on these properties. In general, we have found that phosphorylation by GSK-3β is sufficient for cluster formation. In addition, conditions that alter filament length modify both the density of the filaments in the cluster, and the size of the cluster. Increases in inducer concentration which result in a change from the suboptimal to optimal ratio of inducer:tau concentration in the polymerization reaction increase the filament length within clusters and the area covered by the clusters. This results in clustered filaments that are less densely packed. Conversely, conditions that decrease filament length produce smaller clusters that contain a higher density of filaments.

With this newly developed in vitro model, we can begin to dissect the molecular mechanisms that are involved in filament aggregations that form NFT-like structures. Further studies will be aimed at understanding whether GSK-3β phosphorylation unmasks regions of tau molecules that interact with one another in forming clusters or whether the GSK-3β phosphorylation sites are interacting directly. It is tempting to speculate a role for the former since GSK-3β phosphorylation results in an SDS-resistant conformational change as observed by an upward shift in mobility on SDS page analysis. The apparent increase in initial polymerization velocity as monitored by ThS fluorescence also suggests that the GSK-3β phosphorylated tau may be in a conformation that more readily interacts with the ARA inducer or with the ThS as used to detect amyloid-type interactions in tau kinetic analyses. Although the co-localization of GSK-3β with tau pathology in AD suggests that NFTs may form from the direct interaction of GSK-3β with tau filaments [15], our mock-phosphorylation results strongly suggest that phosphorylation is the primary role of GSK-3β in promoting cluster formation.

This in vitro model for NFT formation requires the induction of tau polymerization via the addition of ARA, which may lead to the questioning of its physiological relevance. An inducer of tau polymerization in AD and other neurodegenerative disorders has not been identified, but that does not dampen our enthusiasm for the use of ARA as an inducer in our cell-free in vitro model system. This is due to ample evidence that ARA induced tau filaments are structurally similar to filaments from AD [42, 48–51]. Additionally, there is growing evidence that ARA or its metabolites could be involved in the neurodegenerative process in AD (reviewed in [52]). While a direct connection between tau polymerization and ARA remains to be made in AD, the structural similarity between ARA induced filaments and AD filaments, plus the similarity between GSK-3β induced NFT-like clusters of tau filaments and those found in AD provide a strong argument for the physiological relevance of this model. In addition to the characterization of the GSK-3β induced clustering of filaments, this in vitro model provides a tool for investigating whether other kinases such as cyclin dependent kinase 5 or microtubule affinity regulating kinase have similar properties to induce the formation of NFT-like filament bundles. Likewise, other modifications found in association with AD NFTs, such as truncation, ubiquitination, nitration and glycation (reviewed in [1, 10]) could also be tested. Our hope is that these ongoing studies will isolate factors contributing not only to the formation of NFT-like clusters, but also to identify the conditions that could lead to potentially toxic tau aggregates in cell and animal culture models.


Comentarios

This is an interesting study that suggests the field may have to change the way they think about tau phosphorylation in Alzheimer's disease. Tau phosphorylation has historically been thought of as a contributor to neurofibrillary tangle formation and disease-associated tau toxicity, but in this study Ittner et al. identify that phosphorylation of tau on threonine 205 may actually serve a protective role. This is of note as phosphorylation of tau at this site has often been used as a measure of disease pathology and is the recognition site of the commonly used &ldquoAT8&rdquo tau antibody as well many commonly used reagents.

The authors identify p38γ, a previously underappreciated isoform of p38, as a tau kinase that preferentially phosphorylates T205. Surprisingly, loss of p38γ enhanced rather than suppressed tau-based toxicity. This could be explained through the observation that phosphorylation of T205 resulted in dissociation of tau/fyn/PSD-95 complexes, which was identified as a mechanism of tau-based neurotoxicity by the authors in a previous study. From a therapeutic perspective, a wealth of data is presented supporting p38γ as the key kinase regulating tau T205 phosphorylation, though unfortunately the development of compounds that act as kinase activators has proven far less tractable than kinase inhibitors. Therefore, more work is likely needed in order to translate these discoveries into development of new treatments for Alzheimer's disease.

Overall the study is comprehensive, well-designed, and contains a number of loss-of-function and gain-of-function experiments with both tau and p38γ that solidify their conclusions. It is a nice addition to our understanding of tau function and will surely provide a starting point for a range of future work.

This is a well-done study. Although the authors have not pointed it out, one very intriguing possible conclusion that can be drawn is that the Aβ drug trials, especially immunotherapies, continue to be negative because tau in AD brain is hyperphosphorylated at Thr 205, along with several other sites, which protects AD brain from Aβ-induced neurotoxicity and hence removal of Aβ will not have any beneficial therapeutic effect.

I believe a serious problem with this present study, and for that matter for many other such studies on the etiopathogenic relationship between Aβ and tau pathologies, is the use of highly artificial overexpression/knockout transgenic mice, which can grossly alter the quantitative effects and hence the outcome.

The hyperphosphorylation of tau has long been proposed to contribute to the tau pathology in Alzheimer&rsquos disease and other tauopathies. However, owing to the number and heterogeneity of phosphorylation sites on tau, investigating the exact role of phosphorylation of tau in neurodegeneration proves to be a challenge. Although hyperphosphorylation of tau is generally regarded as a culprit of neurodegeneration, hyperphosphorylation of tau occurs in other transient situations (e.g., hibernation, stress) without causing lasting side effects. In their recent paper, the Ittner brothers provide evidence that the phosphorylation of tau at Thr205 by P38γ can even be protective because it can suppress excitotoxicity induced by Aβ or PTZ. This is because the phosphorylation at Thr205 of tau disrupts the formation of NMDA-Receptor/PSD-95/tau/Fyn complexes, which mediate Aβ or PTZ induced excitotoxicity. This interesting result expands on the earlier studies of the Ittner and Götz team (Ittner et al., 2010), which assigned a physiological role to the small fraction of tau found in dendrites (which is otherwise mainly axonal). The Thr205 residue is one of several Ser-Pro or Thr-Pro motifs in tau that are targeted by several proline-directed kinases involved in cellular signaling pathways, including those of the JNK family. This type of phosphorylation has been under intense scrutiny, and therefore the current study can be compared to others, leaving several issues to be clarified in the future:

(1) Mondragon-Rodriguez and colleagues reported that phosphorylation of tau can suppress excitotoxicity and thus can serve as a regulatory mechanism to prevent NMDA receptor overexcitation (Mondragon-Rodriguez et al., 2012). These authors focused on phosphorylation of tau at the phospho-epitopes AT180, AT8, or AT100, also representing Ser-Pro or Thr-Pro sites, which reduces tau's interaction with PSD-95. This is at variance with the current study demonstrating that only phosphorylation at Thr205 reduces the association of tau with PSD-95 and Fyn.

(2) The current study showed that the kinase P38γ phosphorylates tau at Thr205 and to a lesser extent at Ser199 (included in the phospho-epitope AT8, a widely used antibody to characterize phosphorylated tau), but not at Ser 202 (included in the phospho-epitope AT8) and hardly any at Ser396 and Ser404 (epitopes of PHF1, another commonly used antibody against phospho-tau). On the other hand, several earlier studies (for instance, Buee-Scherrer and Goedert, 2002 Goedert et al., 1997) revealed that P38γ phosphorylates tau not only at AT8 sites, but also strongly at the PHF1-epitope pSer396/pSer404. It is not clear whether this discrepancy is due to the difference of antibodies used in these studies, since the current Ittner paper used antibodies with epitopes of a single phosphorylation site (pT205, pS202 etc.), while the other studies used antibodies against a combination of multiple phosphorylation sites (e.g. AT8, PHF1).

The present study also shows that the P38γ level is reduced in old APP23 mice but not in young APP23 mice (Fig.S10), compared to wild-type mice. On the other hand, the APP23 mice display enhanced epileptiform activity at four months, when there is no P38γ reduction. Therefore, there must be mechanisms independent of P38γ underlying the Aβ-induced hyperexcitotoxicity in the young APP mice whose nature deserves attention in future experiments.


Referencias

Lu, P.-J., Wulf, G., Zhou, X. Z., Davies, P. & Lu, K. P. Naturaleza 399, 784–788 (1999).

Lu, K. P., Hanes, S. D. & Hunter, T. Naturaleza 380, 544–547 (1996).

Yaffe, M. B. et al. Ciencias 278, 1957–1960 (1997).

Vincent, I., Rosado, P. & Davies, P. J. Cell Biol. 132, 413–425 (1996).

Kondratick, C. M. & Vandré, D. D. J. Neurochem. 67, 2405–2416 (1996).

Pope, W. B. et al. Exp. Neurol. 126, 185–194 (1994).

Illenberger, S. et al. Mol. Biol. Celda 9, 1495–1512 (1998).

Hasegawa, M. et al. J. Biol. Chem. 267, 17047–17054 (1992).

Watanabe, A. et al. J. Biol. Chem. 268, 25712–25717 (1993).

Ishiguro, K. et al. FEBS Lett. 325, 167–172 (1993).

Goedert, M. et al. Biochem. J. 301, 871–877 (1994).

Matsuo, E. S. et al. Neuron 13, 989–1002 (1994).

Morishima-Kawashima, M. et al. J. Biol. Chem. 270, 823–829 (1995).

Goedert, M., Crowther, R. A. & Spillantini, M. G. Neuron 21, 955–958 (1998).

Vincent, I., Jicha, G., Rosado, M. & Dickson, D. W. J. Neurosci. 17, 3588–3598 (1997).

Nagy, Zs., Esiri, M. M., Cato, A.-M. & Smith, A. D. Acta Neuropathol. 94, 6–15 (1997).

Busser, J., Geldmacher, D. S. & Herrup, K. J. Neurosci. 18, 2801–2807 (1998).


ABSTRACTO

Neurofibrillary tangles (NFTs), consisting of abnormally hyperphosphorylated tau, are implicated in the pathogenesis of several neurodegenerative diseases including Alzheimer's disease (AD). The molecular mechanisms underlying the regulation of tau phosphorylation are largely unknown. While the PI3K/Akt pathway has been shown to regulate multiple cellular events pertinent to AD pathogenesis, potential functions of tumor suppressor phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10 (PTEN) in AD pathogenesis have not been explored. Here, we examine the effects of PTEN on tau phosphorylation, its microtubule association and formation of aggregates, and consequentially neuronal morphology. In cultured cells, overexpression of wild-type (WT) PTEN alters tau phosphorylation at several sites, increases tau-microtubule association and decreases formation of tau aggregates. In addition, the phosphatase-null PTEN increases tau aggregation and impairs tau binding to microtubule and neurite outgrowth of neurons expressing the mutant PTEN. We also found a significant loss of PTEN in AD patient brains correlated with a dramatically increased concentration of phospho-tau at Ser-214 in NFTs. Together, our results demonstrate that PTEN regulates tau phosphorylation, binding to microtubules and formation of aggregates and neurite outgrowth. These findings suggest a link between malfunction of PTEN and tauopathy, and imply PTEN as a therapeutic target for tauopathy.—Zhang, X., Li, F., Bulloj, A., Zhang, Y.-w., Tong, G., Zhang, Z., Liao, F.-F., Xu, H. Tumor-suppressor PTEN affects tau phosphorylation, aggregation, and binding to microtubules. FASEB J. 20, E605–E613 (2006)

A key pathological hallmark for Alzheimer's disease (AD) is intracellular neurofibrillary tangles (NFTs), whose major component is bundles of paired helical filaments (PHF) of hyperphosphorylated tau proteins (1). The biochemical study of neuropathological lesions has revealed that such intracellular tau filamentous deposits occur numerous other neurodegenerative diseases as well, including Pick's disease (PiD), corticobasal degeneration (CBD), progressive supranuclear palsy (PSP), argyrophilic grain disease and frontotemporal dementia and parkinsonism linked to chromosome 17 (FTDP-17) (2). The evidence for a causal role of tau aggregation in neurodegenerative diseases was provided by the genetic analyses of the inherited FTDP-17, which led to identification of tau mutations that cause the disease (3–5).

Tau is a class of microtubule-associated protein (MAP) in neuronal and glial cells, which exist in six tau splicing variants in human brain. The tau protein is normally expressed in cytoplasm including cell bodies, neurites, and axons, where it binds to and stabilizes microtubules (6–8). Tau can be phosphorylated at several serine or threonine sites before proline. Numerous kinases, including CDK5 (cyclin-dependent kinase 5), GSK-3 (glycogen synthase kinase-3), MAPK (mitogen-activated protein kinase), protein kinase A (PKA), protein kinase (PKC), and Akt have been identified to phosphorylate tau in vitro (9). Tau is phosphorylated under normal physiological conditions, carrying 2–3 phosphates per molecule. However, hyperphosphorylation of tau, which renders tau 3–4 times more phosphates (10, 11), will cause dysfunction of tau (12), tau aggregation, and likely NFTs formation (13).

The tumor suppressor gene Pten (phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10), also known as MMAC1 y TEP1, is the second most frequently mutated gene after p53 in many human sporadic and hereditary cancers (14–17). PTEN contains a tyrosine phosphatase functional domain, exhibiting both protein and lipid phosphatase activity in vitro (18). The phosphatidylinositol (3–5)-triphosphate (PIP3) has been identified as a major lipid substrate for PTEN (15, 16), but the putative substrates of PTEN with proteinaceous nature are unknown. PTEN antagonizes the phosphoinositide 3-kinase (PI3K) signaling to govern a variety of crucial cellular functions, including cell proliferation, migration, and apoptosis (19, 20). Therefore, the lipid phosphatase activity of PTEN is critical for its tumor-suppressor function (21). Pten-null mice die at early embryonic stages, and heterozygous knockout mice develop a number of tumors (22–25). Mouse brains with conditionally inactivated Pten showed an increased soma size of neurons without altering proliferation (26, 27). A recent study showed decreased levels and altered distribution of PTEN along with elevated PI3K signaling in AD patient brains, suggesting that a loss of PTEN contributes to neurodegeneration in AD (28).

Akt and GSK-3 are two major downstream effectors of the PIP3 pathway. PTEN down-regulates Akt, which in turn activates GSK-3. GSK-3 has been shown to phosphorylate tau at multiple sites in vitro y en vivo (29–33). The observation that Akt/GSK-3 can affect tau phosphorylation raises a possibility that PTEN may also modulate tau phosphorylation. In the present study, we have analyzed tau phosphorylation and investigated whether the altered phosphorylation of tau by PTEN leads to changes in tau aggregation and microtubulebinding ability in cultured cells and primary neurons. We demonstrate that WT PTEN modulates tau phosphorylation at certain residues reducing tau aggregation and promoting its microtubule binding, while lipid phosphatase-null PTEN has opposite effects. In addition, we observe a decreased concentration of PTEN accompanied by increased phospho-tau at Ser-214 (a major Akt site) in AD brains.


Resultados

The relative levels of phosphorylation of tau by JNK1, JNK2, JNK3, SAPK4, ERK2, GSK3β, DYRK1A and PKA were determined using the incorporation of 32 P and autoradiography (Fig. 2). SAPK4 was the best at phosphorylating tau, followed by JNK2, JNK3 and JNK1. The latter enzymes incorporated 79, 40 and 37% of label, when the amount of radioactivity in tau following phosphorylation by SAPK4 was taken as 100%. This value was 20% for ERK2 and GSK3β, 9% for DYRK1A and 4% for PKA. The extent of phosphorylation of tau protein was reflected in its reduced gel mobility (Fig. 2). Thus, phosphorylation by SAPK4 and JNK2 resulted in the highest apparent molecular mass of tau. Phosphorylation by JNK3 and JNK1 gave rise to broader bands of slower migrating tau. Lesser mobility shifts were seen upon phosphorylation by ERK2 and GSK3β, whereas tau phosphorylated by DYRK1A and PKA showed no change in mobility.

Relative levels of phosphorylation of human tau protein by JNK1, JNK2, JNK3, SAPK4, ERK2, GSK3β, DYRK1A and PKA. (a) Relative levels of 32 P-radioactivity incorporated into tau following phosphorylation, with the value for SAPK4 taken as 100%. Phosphorylated tau was resolved on SDS-PAGE and quantitated by PhosphorImager (Molecular Dynamics, Inc.) analysis (arbitrary units). The results are shown as the means ± SEM (norte = 5). (b) Autoradiogram (AR) of a typical experiment showing tau before and after phosphorylation.

Phosphorylation-dependent anti-tau antibodies were used to identify phosphorylated amino acid residues (Fig. 3, Table 1). Tau phosphorylated by SAPK4 and JNK2 gave similar patterns on immunoblots. It was strongly labelled by antibodies AT270, pS199, AT8, pS202, pT205, pT212, pT217, AD2, pS396, pS404 and AP422, and weakly by AT180 and pT231. Tau phosphorylated by JNK3 was strongly labelled by AT270, pS202, pT205, pS396 and AP422, and weakly by pS199, AT8, pT212, pT217, AD2 and pS404. Tau phosphorylated by JNK1 was strongly labelled by pS199, pS202, pT212, pS404 and AP422, and weakly by AT8, pT205, pT217, pS396 and AD2. Tau phosphorylated by ERK2 was strongly labelled by AT270, pS202 and AP422, and weakly by pS199, pT205, pT217, pT231, AD2, pS396 and pS404. Tau phosphorylated by GSK3β was strongly labelled by pS199, AD2, pS396 and pS404, and weakly by AT270, AT8, pS202 and pT205. Tau was phosphorylated at T212 by DYRK1A and at S214 by PKA. The epitope of antibody AT100 was not generated by any of the protein kinases used. When phosphorylated by the combination of GSK3β and JNK2, GSK3β and JNK3 or GSK3β and SAPK4, tau became strongly immunoreactive with antibody AT180, but not with antibody AT100 (Fig. 4). The combination of DYRK1A and PKA or GSK3β and PKA failed similarly to generate the AT100 epitope, even in the presence of 50 µg/mL heparin (data not shown).

Immunoblot analysis of phosphorylation of human tau protein by JNK1, JNK2, JNK3, SAPK4, ERK2, GSK3β, DYRK1A and PKA. Blots were incubated with anti-tau serum BR134 and the phosphorylation-dependent anti-tau antibodies AT270, pS199, AT8, pS202, pT205, pT212, pS214, pT217, pT231, AT180, AD2, pS396, pS404 and AP422. cont, No kinase.

Antibody Epitope [phosphorylation site(s)] Kinase
JNK1 JNK2 JNK3 SAPK4 ERK2 GSK3β DYRK1A PKA
AT270 Thr181 + + + + + + + + + + + +
pS199 Ser199 + + + + + + + + + + + + +
AT8 Ser202 + Thr205 + + + + + + + + + + + +
pS202 Ser202 + + + + + + + + + + + +
pT205 Thr205 + + + + + + + + + + + +
AT100 Thr212 + Ser214
pT212 Thr212 + + + + + + + + + + + +
pS214 Ser214
pT217 Thr217 + + + + + + + + + + + + + +
AT180 Thr231 + + + +
pT231 Thr231 + +
AD2 Ser396 + Ser404 + + + + + + + + + + +
pS396 Ser396 + + + + + + + + + + + +
pS404 Ser404 + + + + + + + + + + + + + + +
AP422 Ser422 + + + + + + + + + + + + +
  • –, no immunoreactivity +, weak immunoreactivity + +, strong immunoreactivity + + +, very strong immunoreactivity.

Immunoblot analysis of phosphorylation of human tau by JNK2, JNK3 and SAPK4, alone or in combination with GSK3β. GSK3β was added either at the same time as JNK2 (JNK2/GSK3β), JNK3 (JNK3/GSK3β) and SAPK4 (SAPK4/GSK3β), or 9 h after JNK2 (JNK2 + GSK3β), JNK3 (JNK3 + GSK3β) and SAPK4 (SAPK4 + GSK3β), or 9 h before JNK2 (GSK3β + JNK2), JNK3 (GSK3β + JNK3) and SAPK4 (GSK3β + SAPK4). Blots were incubated with the phosphorylation-independent anti-tau serum BR134 and the phosphorylation-dependent anti-tau antibodies AT180 and AT100. A68fr denotes sarkosyl-insoluble tau extracted from the brains of 5-month-old mice transgenic for human P301S tau protein ( Allen et al. 2002 ).

We examined whether phosphorylation by JNK1, JNK2, JNK3 and SAPK4 influences the ability of tau to promote microtubule assembly (Fig. 5). Phosphorylation of tau by SAPK4 strongly reduced microtubule assembly, followed by JNK2, JNK3 and JNK1. The rates of polymerization calculated at 2 min after starting polymerization were 0.1%, 0.6%, 1.5% and 19.4%, respectively, with the value for non-phosphorylated tau taken as 100%.

Effects of phosphorylation by JNK1, JNK2, JNK3 and SAPK4 on the ability of tau to promote microtubule assembly. Polymerization of tubulin was monitored by turbidity over time following the addition of either non-phosphorylated tau (no kinase), or tau phosphorylated by JNK1, JNK2, JNK3 or SAPK4. No change in turbidity was observed in the absence of tau (dotted line). A typical experiment is shown. Similar results were obtained in three separate experiments.


Agradecimientos

This work was supported by the UK Medical Research Council and the Alzheimer’s Research Trust. The authors thank Dr P. Seubert (Elan Pharmaceutials) for the 12E8 antibody, and Drs A. Dérevier and CJ. Zhao for help with the preparation of primary neuronal cultures.

Figure S1. Substrate specificity of AMPK-related kinases. AMPK-related kinases (1 U/mL) were assayed using 0.1 mM of either AMARA peptide (AMARAASAAALARRR) or CHKtide (KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR), as described in MATERIALS AND METHODS. The activities (relative 32P-labeling) are presented as the average ± SD of three separate experiments, with each determination performed in triplicate.

As a service to our authors and readers, this journal provides supporting information supplied by the authors. Such materials are peer-reviewed and may be re-organized for online delivery, but are not copy-edited or typeset. Technical support issues arising from supporting information (other than missing files) should be addressed to the authors.

Nombre del archivo Descripción
JNC_7523_sm_FigS1.pdf89.4 KB Elemento de información de apoyo

Please note: The publisher is not responsible for the content or functionality of any supporting information supplied by the authors. Cualquier consulta (que no sea contenido faltante) debe dirigirse al autor correspondiente del artículo.