Información

2.6: Huella de ADN del sitio lac Operon CAP - Biología

2.6: Huella de ADN del sitio lac Operon CAP - Biología



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Los E. coli operón lac

Figura 2.6.1: lac Operon

  • laca Z códigos para b-galactosidasa, que es una enzima que escinde b-galactósidos (por ejemplo, lactosa).
  • laca Y códigos para penetrar, que participa en el transporte de b-galactósidos al interior de la célula.
  • laca A códigos para b-galactósido transacetilasa, que acetila b-galactósidos.
  • Una mutación en cualquiera laca Z o laca Y puede conducir a un laca- genotipo, es decir. células que no pueden utilizar b-galactósidos como nutriente.
  • A laca El mutante A, que carece de actividad transacetilasa, todavía puede utilizar b-galactósidos (sigue siendo el genotipo lac +). Su papel en el metabolismo de los bgalactósidos no está claro.

Promotor

una región de ADN involucrada en la unión de la ARN polimerasa para iniciar la transcripción.

Terminator

una secuencia de ADN que hace que la ARN polimerasa termine la transcripción.

  • El grupo de tres genes, laca ZYA, se transcribe en un solo ARNm (policistrónico mensaje) de un promotor solo corriente arriba del laca Gen Z
  • En el ausencia de un inductor el grupo de genes es no transcrito.
  • Cuando un inductor se agrega (p. ej. lactosa, o el análogo no hidrolizable isopropil tiogalactósido - IPTG) la transcripción comienza en un solo promotor (laca PAG) y procede a través de los genes lac ZYA hasta una secuencia de terminación ubicada aguas abajo del lac A gene.

Nota

El ARNm de lac ZYA tiene una vida media de ~ 3 minutos, lo que permite revertir la inducción con relativa rapidez (es decir, las células dejan de producir enzimas rápidamente después de que se detiene la inducción).

Ejercicio 2.6.1

¿Con qué molécula interactúa el inductor (lactosa) para afectar la regulación transcripcional (es decir, la inducción del operón lac)?

Respuesta

No es b-galactosidasa, permasa o transacetilasa, sino que es una proteína separada llamada proteína represora.

  • Los genes lac están controlados por un mecanismo llamado regulación negativa.
    • Esto significa que se transcriben a menos que sean desactivados por la proteína reguladora.
    • Una mutación que inactiva la proteína reguladora causa el lacaGenes ZYA para ser expresado continuamente.
Dado que la función de la proteína reguladora es prevenir la expresión, se denomina proteína represora.

Hay dos tipos de genes en el operón lac:

  1. Genes estructurales - codifican las enzimas necesarias para alguna vía bioquímica (por ejemplo, lac Z, Y y A).
  2. Genes reguladores - codifican proteínas implicadas en la regulación de genes estructurales.
Mutaciones en estructural los genes generalmente afectan la función de solo ese gen estructural.
Mutaciones en regulador los genes pueden afectar la expresión de todos los genes estructurales en un operón.

laca I es el gen regulador del operón lac.

  • Este gen se encuentra justo corriente arriba de la región promotora de los genes estructurales lac.
  • los laca Yo gene tiene el suyo promotor (constitutivo) y terminador.
  • Emite un mensaje monocistrónico y codifica una proteína: la laca proteína represora.
La característica crucial del "circuito de control" de lac reside en la característica dual de la proteína represora lac I:
  1. Puede prevenir la transcripción
  2. Puede reconocer y unirse al inductor de molécula pequeña (lactosa o IPTG)

Prevención de la transcripción por el represor lac

  • represor lac (activo como tetramérico proteína) se une a una secuencia de ADN llamada operador (laca O región).
    • La región del operador se encuentra entre laca región promotora (sitio de unión de la ARN polimerasa e inicio de la transcripción) y la laca Gen Z
    • Los primeros 26 pares de bases del laca El gen Z comprende la región del operador.
Cuando el represor se une a la región del operador, su presencia evita que la ARN polimerasa inicie la transcripción en el promotor..
  • No es que la proteína represora "bloquee" el movimiento de la ARN polimerasa a través del laca Gen Z
  • La unión del represor y la unión de la ARN polimerasa (al promotor) son mutuamente excluyentes en el laca promotor / operadorlaca PO) región.

¿Cómo cambia la interacción represor / operador en presencia de la molécula inductora?

  • los inductor puede unirse al represor para formar un complejo represor / inductor que ya no se asocia con el operador.
    • La característica clave de esta interacción es que la proteína represora tiene dos sitios de unión, uno para el inductor y uno para el operador.
    • Cuando el inductor se une en su sitio, cambia la conformación de la proteína represora de modo que el sitio de unión del operador tiene una afinidad mucho menor por la región del operador del ADN.
    • Este tipo de control se llama control alostérico.
    • El resultado es que cuando se agrega el inductor, el represor se convierte en una forma que se libera del operador.

Figura 2.6.2: Inductor

El control positivo del operón lac lo ejerce el complejo cAMP-CAP

  • E. coli prefiere glucosa sobre otras fuentes de carbono.
Cuando la glucosa ingresa a una célula de E. coli, se utiliza directamente sin inducción de nuevas enzimas..
  • Cuando E. coli se cultiva en glucosa, si se agrega otro azúcar (por ejemplo, lactosa) la inducción de enzimas para utilizar el otro azúcar no ocurre hasta que se agota la glucosa.
  • Cuando la E. coli se muere de hambre por glucosa, sintetiza un nucleótido inusual: monofosfato de adenosina cíclico de 3'5 ' (AMP cíclico, o acampar):

Figura 2.6.3: acampar

  1. En las bacterias, un aumento en el nivel de cAMP parece ser una señal de "alerta" que indica un nivel bajo de glucosa:

Figura 2.6.4: Interacción del nivel de AMPc y el operón lac

AMPc de dibutirilo

  • un término análogo de cAMP que puede atravesar el E. coli membrana y dentro de la célula.
  • Si esto se agrega a los medios que contienen glucosa y lactosa, resultará en la inducción de El laca operón.
  • Por lo tanto, imita el mensaje químico que engaña al E. coli para responder como si los niveles de glucosa fueran bajo.
  • Mutantes de E. coli se han aislado que no pueden inducirse a metabolizar alguna azúcar que no sea glucosa. Había dos categorías generales de mutantes:
  1. Clase I. Defectuoso en la enzima adenilato ciclasa. Estos mutantes son incapaces de producir AMPc incluso cuando la concentración de glucosa es baja.
  2. Clase II. Carece de una proteína particular conocida como proteína receptora de AMPc (CRP) o también conocida como proteína receptora de catabolitos (CRP).
  • Transcripción máxima del laca operón requiere la presencia de un cAMP / CRP complejo.
    • El complejo cAMP / CRP se une a una secuencia específica en la región de control lac llamada "GORRA"sitio.
    • El sitio CAP es solo río arriba del sitio de unión de la ARN polimerasa.
    • Las mutaciones en el sitio CAP que previenen la unión de cAMP-CRP también previenen altos niveles de expresión del laca operón.
  • Por lo tanto, el complejo cAMP / CRP unido activa transcripcióncontrol positivo), mientras que atado laca represor inhibe transcripcióncontrol negativo).
    • El complejo cAMP / CRP tiene afinidad por el ADN y el ARN pol.
    • Mejora la formación de complejos de ARN pol con la región promotora de ADN.

Inducción de la laca operón con análogos de lactosa

  • los laca El operón se puede inducir con lactosa
    • b-galactosidasa (lacaProducto del gen Z) metaboliza la lactosa
    • Cuando se reducen los niveles de lactosa, la laca el operón es nuevamente reprimido por el laca represorlacaGenero producto)
  • Análogos de lactosa no metabolizados continuamente puede inducir (es decir, des-reprimir) la laca operón
    • isopropil b-tiogalactósido, o IPTG, es un análogo de lactosa no metabolizado

Experimentos de "huella" de ADN

  • Si una proteína se une a una región del ADN, Puede proteger esa región del ADN de la digestión por ADNasa. (ADNasa I: una endonucleasa en sitios adyacentes a nucleótidos de pirimidina).
    • Un fragmento de ADN se puede marcar en los extremos 5 'con 32P y luego el marcador se puede eliminar preferentemente de un extremo (es decir, el extremo 3 'de un gen) mediante una endonucleasa de restricción apropiada.
    • Si este fragmento de ADN, con una etiqueta en un extremo específico, forma un complejo con una proteína de unión a ADN, la proteína protegerá la región de ADN a la que se une de la digestión de la ADNasa I.
    • La digestión se realiza de manera que sea incompleta, para los propósitos de esta discusión, imagine que cada molécula de ADN se escinde solo una vez. Además, el sitio de escisión se elige al azar entre los sitios disponibles.
    • Los fragmentos del ADN, separados y analizados por tamaño (usando electroforesis en gel) después de la digestión, indicarán la región protegida:

Figura 2.6.5: Huella de ADN

Resultados de los experimentos de huellas

laca ADN incubado con proteína cAMP / CAP, ARN polimerasa o proteína represora lac I:

Figura 2.6.6: represor lac con cAMP

La ARN polimerasa interactúa con secuencias promotoras específicas y produce una "huella" en una región de ~ 70 pares de bases.

  • Se observó que esta protección era más obvia en una hebra que en la otra (es decir, si la otra hebra estaba etiquetada, los resultados no mostraban tanta protección).
  • Esta región de protección de la ADNasa incluía sitios en el ADN a partir de los cuales los experimentos de mutagénesis produjeron una regulación "hacia arriba" o "regulación hacia abajo" de la fuerza del promotor.
  • Estos puntos "calientes" mutagénicos que afectan la fuerza del promotor se ubicaron en las posiciones -10 o -30 corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción (posición +1 en el diagrama anterior):

Figura 2.6.7: Mutaciones de la fuerza del promotor

  • Los promotores se pueden clasificar según su "fuerza".
  • Esto se refiere al relativo frecuencia de inicio de la transcripción (eventos de iniciación transcripcional por minuto), y está relacionado con la afinidad de la ARN polimerasa por la región promotora.
  • Muchos promotores en E. coli se han caracterizado y se ha identificado una secuencia promotora de "consenso":

Figura 2.6.8: Fortaleza del promotor de consenso

Nota

El promotor lac es relativamente débil promotor

Polimerasa de ARN

  • E. coli La ARN polimerasa es una holoenzima compuesta por subunidades b ', b, a (dímero) ys70.
    • La s70 subunidad es la subunidad que se une a la región promotora, pero no puede iniciar la síntesis de ARN.
    • Después de la s70 la subunidad se une a la subunidad, las otras subunidades se unen formando una función ARN polimerasa.
    • Después de aproximadamente 10 pares de bases se han transcrito el s70 subunidad sale de y el polimerasa de núcleo continúa.

Los laca Región del operador

  • los laca La región del operador se compone de un (imperfecto) repetición invertida región.
  • No es sorprendente que las moléculas represoras activas estén compuestas por un homodímero.
    • En la estructura del homodímero hay un par de regiones de hélice a que se insertan en los surcos principales adyacentes del ADN.
    • La separación es de aproximadamente 34 angstroms.

Resumen de respuestas revisado

Mi respuesta original proporcionó evidencia de que el represor trp es un dímero, y esa conclusión es válida, especialmente en lo que respecta a su forma funcional. Sigo considerando incorrecta la afirmación en Wikipedia de que es un tetrámero, aunque ahora veo cómo podría haber surgido. Parece ser una mala interpretación de los resultados in vitro que muestran que puede existir un equilibrio entre el dímero y el tetrámero (no solo el tetrámero). Me he extendido sobre esto en una sección adicional.

Un dímero funcional

La forma funcional del es ciertamente un dímero, como informaron originalmente Schievitz et al. (1985). El resumen de este documento incluye la declaración:

“La estructura cristalina del represor trp de Escherichia coli se ha resuelto a resolución atómica. La proteína dimérica tiene una interfaz de subunidades notable en la que cinco de las seis hélices de cada subunidad están interconectadas ".

Se cristalizó en combinación con el ADN del operador y la estructura se depositó en la base de datos de proteínas (PDB) como 1TRO. Reproduzco una imagen de la entrada de PDB a continuación. Muchas otras proteínas de unión al ADN también tienen estructuras diméricas.

Un equilibrio dímero-tetrámero observado en solución

La afirmación en Wikipedia probablemente surge de un informe de Fernando y Royer (1992) -confirmado posteriormente- de que en solución existe un equilibrio entre el dímero y los oligómeros superiores (predominando el tetrámero). Se encontró que el triptófano cambia el equilibrio al dímero. Los autores afirman que esto tiene relevancia fisiológica, aunque esto todavía parece un punto discutible.


2.6: Huella de ADN del sitio lac Operon CAP - Biología

BioBuilder y rsquos Dispositivo iTune La actividad enfatiza la fase & ldquotest & rdquo del ciclo de diseño-construcción-prueba. Trabajará con varias variantes de un circuito genético generador de enzimas. Los circuitos tienen pequeñas diferencias en sus secuencias de ADN, que se espera que cambien la cantidad de enzima que producen las células. Utilizará un ensayo enzimático para medir cuantitativamente las salidas de los circuitos y rsquo. Luego comparará sus resultados con lo que predeciría basándose en el comportamiento conocido de las secuencias de ADN ligeramente diferentes.

Para la mayoría de los sistemas de ingeniería, Las diferencias significativas entre el comportamiento observado y predicho son inaceptables.. Como se señala en Figura 7-1, ¿qué pensaría un ingeniero aeronáutico de una nueva forma de ala que, cuando se agrega al cuerpo de un avión, hace que el avión vuele de formas inesperadas? Diseñar y construir frente a tal incertidumbre generaría enormes gastos y potencialmente pondría vidas en peligro. A los ingenieros les resultaría casi imposible avanzar con sus diseños si las combinaciones de piezas simples y mdash fueran tuercas y tornillos o resistencias y amplificadores y mdash dieran lugar a comportamientos inesperados.

Figura 7-1. Comportamientos no deseados. Al modificar la cola estándar de un avión (izquierda) a una forma novedosa (derecha), el ingeniero debe preocuparse por los comportamientos no deseados, por ejemplo, las diferencias que afectan la forma en que el avión puede aterrizar de manera segura.

Las disciplinas de ingeniería más establecidas se basan en componentes modulares que se pueden ensamblar funcionalmente de diversas formas, lo que facilita la personalización de combinaciones de acuerdo con las necesidades de cada individuo. Las piezas no solo necesitan estar conectadas físicamente sino que, cuando están conectadas, también deben comportarse de acuerdo con la especificación. Para hacerlo mas simple, las piezas deben funcionar como se espera cuando se ensamblan.

En este punto en el campo de la biología sintética, los ingenieros biológicos todavía están trabajando hacia ese ensamblaje funcional de partes genéticas. Aunque los investigadores han caracterizado muchos comportamientos celulares a nivel molecular y en muchos casos es posible catalogar los elementos genéticos necesarios y suficientes para llevar a cabo una función biológica.La combinación de estos componentes genéticos de nuevas formas a menudo genera resultados inesperados.. Los biólogos sintéticos pronto podrían ensamblar físicamente el material genético para ensamblar cualquier secuencia deseada con relativa facilidad, pero colocar esa secuencia en un nuevo contexto celular puede afectar su función de manera incierta y cambiante, incluso si la secuencia se ha estudiado a fondo y se ha caracterizado bien. de forma aislada o en otros contextos.

Modularidad, aislamiento, y medición de las piezas son componentes cruciales para permitir dicho ensamblaje funcional, además de la estandarización (ver el Fundamentos de la ingeniería del ADN capítulo para mayor discusión). En este capítulo, exploramos cómo se aplican estos principios adicionales en la ingeniería estándar en general y en la biología sintética en particular. Luego, detallamos el experimento del dispositivo iTune para probar una variedad de circuitos genéticos en las células, con el fin de comparar sus comportamientos esperados y medidos.

La modularidad se refiere a la idea de que los ingenieros pueden diseñar y generar sistemas combinando unidades funcionales o "módulos". Por intuitiva que sea esta noción para la ingeniería, la idea de modularidad se ha aplicado recientemente a las partes genéticas. Es sensato aplicar la modularidad a la biología porque podemos atribuir funciones discretas a fragmentos particulares de ADN; sin embargo, aunque ahora damos por sentado este principio, se requirió una investigación significativa para confirmarlo (consulte la siguiente barra lateral).

GENES COMO MÓDULOS

La biología sintética asume un conjunto de "partes" genéticas que pueden combinarse y manipularse para generar un comportamiento preciso. La idea que subyace a esta premisa es que los rasgos surgen de fragmentos funcionales discretos de ADN es, de hecho, relativamente nueva. No fue hasta que los resultados de los experimentos de Gregor Mendel & rsquos con plantas de guisantes fueron redescubiertos a principios de la década de 1900 que los científicos comenzaron a comprender que los rasgos podían permanecer distintos, allanando el camino para nuestra comprensión actual de la genética.

Durante mucho tiempo, se pensó que la descendencia combinaba los rasgos genéticos de los padres. El meticuloso trabajo de Mendel & rsquos en el cultivo de plantas de guisantes demostró que la mezcla no siempre ocurre y que, a veces, un rasgo puede transmitirse fielmente de una planta madre a una planta descendiente. Mendel realizó estos estudios de herencia contando y midiendo cuidadosamente algunos rasgos clave de sus plantas de guisantes, como el color de las flores y la forma de las vainas. Sus datos mostraron que los rasgos podían permanecer distintos y se transmitían de forma independiente en proporciones predecibles. Sus resultados sugirieron que la herencia debería considerarse en términos de entidades discretas, a las que llamó factores, pero que luego se denominaron genes. Su trabajo mostró cómo estos factores se transmiten de manera predecible entre generaciones. Esta idea se da por sentada hoy en día, pero fue pionera en su época, lo que llevó a la fundación del campo de la genética clásica.

Se necesitaron más de 50 años para proporcionar una explicación molecular de los patrones de herencia que observó Mendel. Nuestro conocimiento moderno se basa en gran medida en la estructura de doble hélice del ADN y rsquos, como lo describen Watson y Crick, y en los estudios clásicos de expresión génica en el operón lac de Jacob y Monod. Gracias a estos avances científicos y otros, ahora entendemos las ideas fundamentales en biología, como el flujo de información genética desde el ADN a través del ARN hasta las proteínas y la refundición de rasgos como secuencias de ADN que codifican una función. La idea de las partes del ADN en la biología sintética es producto de estos logros clásicos.

Los cambios en la industria de la música grabada ofrecen un ejemplo decente (pero no perfecto) de la ventajas obtenidas de una mayor modularidad. Durante gran parte del siglo XX, la forma más común y rentable de distribuir música fue en forma de discos y, más tarde, en cintas de casete y CD. En todos estos formatos, la música se vendió principalmente como álbumes completos. Las canciones individuales estaban disponibles pero eran significativamente más costosas, por lo que incluso si a las personas solo les gustaban algunas de las canciones de un álbum, generalmente compraban el álbum.El álbum fue la & ldquounit & rdquo estándar para la industria de la música y sus artistas. Esta unidad cambió por completo a principios del siglo XXI, cuando se digitalizó la música. Con este avance, fue más fácil descargar música en lugar de comprar el álbum físico. Las canciones de un álbum se desagregaron fácilmente, convirtiendo las canciones en módulos independientes que los oyentes podían mezclar y combinar según lo desearan y necesitaran. La amplia oportunidad de crear listas de reproducción personalizadas a partir de estas canciones modulares ha cambiado la forma en que las personas piensan sobre su colección de música y ha alterado el estándar de la industria.

La modularidad y personalización mejoradas que vemos en la música comercial recapitula nuestras nociones cambiantes de un unidad de expresión génica, que han allanado el camino para el uso del término genético & ldquoparts & rdquo en biología sintética. Los primeros trabajos de Mendel & rsquos mostraron que los rasgos eran entidades discretas. En la analogía con la música grabada, entonces, el organismo que muestra el rasgo puede considerarse análogo al álbum completo y mdash, el rasgo solo existe en el contexto del organismo, así como la canción solo existe en el contexto del álbum completo. El Dr. Francois Jacob y el Dr. Jacques Monod, cuyo trabajo se detalla más adelante en este capítulo, reformularon dramáticamente esta imagen con su descripción del metabolismo de la lactosa, reformulando los rasgos en términos de elementos genéticos dinámicos en lugar de organismos completos con rasgos. Se identificaron tramos particulares de ADN que trabajaban en conjunto para controlar el comportamiento de una célula y rsquos, pero los elementos genéticos dentro de esos tramos eran indivisibles y no se podían personalizar fácilmente para cumplir con un nuevo propósito. Este hito puede considerarse en algún lugar entre las fases & ldquoalbum & rdquo y & ldquosingle & rdquo de la industria de la música. Ahora, En la era de la ingeniería genética y las partes genéticas intercambiables, se conocen muchas secuencias genéticas que codifican funciones específicas y pueden manipularse con precisión.. Podemos personalizar una "lista de reproducción" de estos elementos genéticos recombinándolos de formas especializadas para satisfacer nuestras necesidades. Las técnicas para esta manipulación se describen con más detalle en el Fundamentos de la ingeniería del ADN capítulo. Aquí, exploramos las oportunidades de ingeniería que surgen porque podemos mezclar y combinar partes genéticas.

A medida que los materiales modulares se mezclan y combinan, surgen nuevas complicaciones, incluida la mayor posibilidad de que los módulos puedan interactuar entre sí de formas no deseadas. Una herramienta para minimizar las interacciones imprevistas entre módulos es aislar el comportamiento de las piezas. Considere las opciones modulares disponibles al comprar un automóvil. Puede actualizar el modelo básico de muchas maneras: sistemas de altavoces mejorados, un motor más potente, asientos traseros con calefacción y más. Estos complementos están disponibles gracias, en parte (¡ja!), Al enfoque de diseño modular que emplearon los ingenieros de car & rsquos. Sin este enfoque, el costo de actualizar a un sistema de altavoces elegante sería exorbitante porque la consola frontal tendría que ser completamente rediseñada para adaptarse a cada marca de altavoces. En cambio, la flexibilidad para las actualizaciones integradas se incluyó en las primeras etapas de diseño y, en consecuencia, los cambios en el momento de la compra no requieren esfuerzos de rediseño significativos. Se anticipó la personalización para cada uno de los módulos de automóvil y rsquos, y los diseñadores se esforzaron desde el principio para hacer que las piezas fueran discretas.

Además de crear partes físicamente discretas que se pueden combinar de muchas formas, el ensamblaje funcional requiere que las partes exhiban comportamientos que son separables de los demás elementos que los rodean. Por ejemplo, como Figura 7-2 ilustra, el funcionamiento del estéreo no debe afectar el funcionamiento del volante del conductor y rsquos. Sería un verdadero desafío para la conducción si al girar la perilla de la radio también se girara el volante. Tal La separación de comportamiento entre el funcionamiento de las piezas se denomina aislamiento..

Figura 7-2. Aislamiento en el diseño de automóviles. Un automóvil moderno consta de múltiples componentes, incluidos los asientos, las ruedas, el volante y el estéreo. Los componentes funcionan de forma independiente, por lo que el uso de un componente no interfiere con el funcionamiento de otros componentes del automóvil.

Es difícil lograr un diseño anticipatorio y aislamiento de partes genéticas similares cuando se construye con partes genéticas. La célula es un entorno fluido donde las moléculas, proteínas y estructuras celulares se mezclan constantemente. ¿Cómo es posible aislar sus comportamientos cuando encuentran nuevos socios y vecinos todo el tiempo? Además, & ldquoupgrades & rdquo en una celda puede comportarse como se espera en algunos entornos celulares y no como se espera en otros. La actividad en el Qué mundo tan colorido El capítulo ejemplifica este desafío. Incluso si las actualizaciones parecen funcionar al principio, el entorno local de la celda y el rsquos es dinámico, lo que requiere que los diseños celulares operen en muchas condiciones ambientales y de crecimiento. Finalmente, a diferencia de cualquier otro sustrato de ingeniería, los materiales vivos pueden mutar y lo harán con el tiempo, como exploramos en el Pan de oro capítulo. La evolución del producto de ingeniería hace que el desafío del diseño sea mucho mayor.

Para gestionar toda la complejidad del diseño biológico, podemos utilizar la poderosa herramienta de ingeniería de abstracción, como se describe en el Fundamentos del Biodiseño capítulo, por lo que las decisiones sobre un elemento de diseño se pueden tomar independientemente de las decisiones tomadas para otros elementos. El estéreo de un automóvil y rsquos se puede cambiar sin afectar la dirección. Es más, La modularidad, el aislamiento y la abstracción deben permitir que se tomen decisiones sobre los dispositivos sin tener un impacto en el diseño del sistema.. Volviendo a la analogía del automóvil, no es necesario comprar un camión en lugar de un automóvil solo porque desea tracción delantera.

Pero, ¿qué tan bien funciona este enfoque para la biología sintética en la práctica? A los biólogos sintéticos les gustaría llegar a un punto en el que puedan combinar de manera predecible y racional partes con identidades conocidas y fortalezas relativas en nuevos circuitos sintéticos. Al medir el rendimiento real de los sistemas sintéticos, compuestos por partes bien caracterizadas y comparar las mediciones con lo que se predijo, los bioconstructores pueden evaluar sus diseños y acercarse a anticipar correctamente el éxito o el fracaso de diseños futuros.

Principios de medida

Algunas cosas son difíciles de medir. La felicidad, por ejemplo, no tiene una escala o unidad en la que todos podamos estar de acuerdo, y no existen instrumentos para detectarla de manera confiable. Otras cosas se miden todo el tiempo: podemos asociar un valor numérico a las cartas de un mazo, al promedio de calificaciones o a la clasificación del equipo en una liga deportiva. Ya sea que esté cocinando una comida o comprando ropa del estante, confía en las medidas para numerar, medir, tiempo o contar cosas. Las mediciones informan sobre el estado de los elementos y sus comportamientos, relaciones o características..

Cuando se puede medir algo, las unidades nos brindan una forma común de comparar elementos. Estandarizar las unidades para cada medida no es trivial, como describimos en el Fundamentos de la ingeniería del ADN capítulo, pero para muchos elementos, hay unidades en las que nos hemos puesto de acuerdo. Medir la altura de un caballo en & ldquohands & rdquo es un gran ejemplo. Gracias a Enrique VIII, quien estandarizó una mano a 4 pulgadas, incluso esta unidad anticuada todavía tiene información de medición significativa. Cualquiera que esté familiarizado con la medida de la mano sabe que un caballo de 16 manos de altura mide 64 (16 x 4) pulgadas a la cruz (cerca del hombro) y que otro caballo que mide 16,3 manos mide 67 (16 x 4 + 3) pulgadas, no 65,2 (16,3 x 4) pulgadas.

Las mediciones significativas, sin importar la unidad, son un sello distintivo de los enfoques científicos modernos. Como nos mostró Mendel, podemos ver patrones cuando contamos cosas. Los datos cualitativos también pueden ser muy informativos, como se explora en el Eau That Smell capítulo. Sin embargo, aquí destacamos cómo las mediciones matemáticas nos permiten manipular y convertir información en otras representaciones. Los números también nos permiten hacer comparaciones y predicciones.

Como ejemplo, intente comparar su caminata a la escuela con la de su amigo cuando las medidas cualitativas son todo lo que tiene. En tal caso, te limitarás a decir cosas como, "La escuela está muy lejos de mi casa, mucho más lejos que la tuya, pero yo camino más rápido que tú". Pero midiendo las millas, los tiempos y las velocidades, de repente es posible averigüe qué tan temprano deben salir de casa para reunirse en la escuela a las 8 a. m. Si conoce las distancias y su ritmo de caminata, puede anticipar cuánto tiempo tomará el viaje. Aplicando esta lección a la ingeniería: La medición nos da la capacidad de predecir, que puede ser muy útil, pero solo si podemos realizar las mediciones pertinentes. Lo que hace que una medición sea relevante se describe a continuación.

Qué & rsquos se mide normalmente

Los ingenieros utilizan la medición no solo para describir, sino también para controlar, ensamblar y mejorar los objetos que se miden.. El montaje de piezas modulares ilustra la importancia de las medidas. Para componer de manera confiable una parte con otra, las características relevantes de cada parte deben ser conocidas y deben ajustarse a algún estándar acordado. De lo contrario, los engranajes no giran, las tuercas no encajan en las roscas de los tornillos y los ladrillos Lego no pueden ensamblarse en modelos tanto de la Estrella de la Muerte como de la Torre Eiffel. Al ajustarse a estándares de medición particulares, las piezas modulares se convirtieron en la base de las fábricas modernas y la fabricación eficiente de la línea de montaje. Algunas de las comparaciones y mediciones en las que confían los ingenieros se detallan en Tabla 7-1.

Medición

Descripción

Rendimiento estático

Asigna una gama de entradas controladas a una pieza y una salida final medible rsquos

Útil para garantizar que la salida de una parte y rsquos sea suficiente para activar la siguiente parte en un circuito

Rendimiento dinámico

Una salida parcial y rsquos a lo largo del tiempo en respuesta a un cambio en la señal de entrada

Muestra cómo se comportará un sistema tras la estimulación inicial, que puede diferir del comportamiento estabilizado a largo plazo.

Compatibilidad de entrada

Cómo responde una pieza a varias entradas

Ilustra la flexibilidad de partes y rsquos para la composición con varias partes / entradas ascendentes

Fiabilidad

Medido como tiempo medio de falla (MTF)

Se utiliza para determinar cuánto tiempo se puede esperar que el sistema se comporte como se especificó originalmente.

Consumo de materiales o recursos

Determina la elección de fuente de alimentación o grupo de recursos.

Afecta las decisiones del chasis, entre otras cosas.

Tabla 7-1. Medidas típicas para disciplinas de ingeniería

Realización y notificación de mediciones para biología sintética

Lo que mida le dirá diferentes cosas sobre cómo funcionan los circuitos de ADN sintético en una célula.. La medición más directa de la actividad de un circuito y rsquos se haría si pudiéramos reducirnos a un tamaño microscópico, tal como lo hace la Sra. Frizzle en el Autobús escolar mágico serie de libros, y luego sentarse mágicamente en el ADN para contar el número de polimerasas de ARN que se mueven a lo largo del ADN cada segundo. En términos electrónicos, esto sería como contar electrones a medida que fluyen en una corriente. Sin embargo, experimentalmente más razonable es medir los productos de la transcripción y la traducción. ¿Cuántos ARNm se producen por segundo o cómo se acumula la proteína con el tiempo? Estas mediciones de ARN y proteínas son posibles pero intensivas en términos de equipo, tiempo y experiencia necesarios. Para hacer las cosas un poco más fáciles en BioBuilder y rsquos, actividad de laboratorio de iTunes, y beta-galactosidasa Se mide la actividad (& beta-gal), que es un reflejo indirecto pero bueno del rendimiento de cada circuito.

La experiencia ha demostrado que cuando los circuitos de ADN se mueven de un contexto biológico a otro, Puede ser difícil predecir cómo funcionarán las partes genéticas.. La actividad de una parte se ve afectada de forma variable en muchos niveles, incluidas las tasas de transcripción, traducción y actividad proteica en su nuevo entorno celular. Al desafío del ensamblaje confiable se suma el hecho de que, al componer sistemas vivos hechos de múltiples partes genéticas, es difícil predecir cómo las partes se comunicarán entre sí. Por ejemplo, una señal fuerte "ldquoon" generada por una parte podría no ser lo suficientemente fuerte como para activar una parte descendente con la que se pretende que funcione.

Sin embargo, la biología sintética no es el primer esfuerzo de ingeniería que se enfrenta a estos desafíos de ensamblaje. Un enfoque que han empleado disciplinas de ingeniería más establecidas es desarrollar hojas de datos que describen cómo funcionará una pieza determinada en función de parámetros específicos. Para hacer tales hojas de datos, los ingenieros deben recopilar datos suficientes para describir completamente su parte, probándolas con entradas particulares y en muchas condiciones y entornos diferentes.

Los biólogos sintéticos pueden crear hojas de datos similares para sus partes. Por ejemplo, una hoja de datos que & rsquos ha sido publicada para un factor de transcripción en el Registro de Partes Biológicas Estándar informa el rendimiento estático, rendimiento dinámico, compatibilidad de entrada y confiabilidad de la pieza & rsquos. Estos son los mismos parámetros descritos anteriormente en Tabla 7-1. Idealmente, estas mediciones y descripciones del comportamiento de las piezas y los rsquos se mantendrían siempre que se utilicen. Sin embargo, incluso Si su comportamiento difiere según el contexto, las instrucciones y la información de la hoja de datos de piezas y rsquos pueden permitir que un bioconstructor tenga en cuenta esta variabilidad.. Este enfoque de & ldquodata-sheet & rdquo solo funciona para piezas que varían de manera confiable y predecible, lo cual no siempre es el caso, pero es un primer paso importante hacia la estandarización funcional.

Otro factor que contribuye a la robustez percibida de una pieza (o falta de ella) es la variabilidad normal de laboratorio a laboratorio en las técnicas de medición. Incluso es poco probable que dos personas en el mismo laboratorio que miden lo mismo obtengan valores idénticos debido a variaciones sutiles en la técnica, los medios, el estado de crecimiento celular y quién sabe qué más. Los biólogos sintéticos están interesados ​​en identificar las causas subyacentes de estas variaciones, pero aprecian que este es un objetivo a largo plazo. Mientras tanto, Puede utilizar referencias de calibración para comparar las mediciones realizadas en un lugar con las mediciones realizadas en otro.. El laboratorio de dispositivos iTune de BioBuider & rsquos utiliza un estándar de referencia precisamente por esta razón.

Conceptos fundamentales para el laboratorio de dispositivos iTune

En esta actividad de BioBuilder, puede explorar la actividad biológica de partes genéticas que se espera que funcionen en combinación para generar diferentes cantidades de una enzima. Cada una de estas partes se ha caracterizado independientemente como & ldquoweak, & rdquo & ldquomedium, & rdquo o & ldquostrong & rdquo. Esta actividad pregunta qué tan bien puede anticipar el comportamiento de estas partes caracterizadas individualmente cuando se combinan de diferentes maneras. Para comenzar, es esencial comprender la expresión génica y el papel del promotor y las partes del sitio de unión del ribosoma, como se describe a continuación.

Promotores y RBS

A menudo denominado "dogma central" de la expresión génica, el mantra "ldquoDNA hace que el ARN produzca proteínas" es una abreviatura del principio de que las proteínas se ensamblan mediante la traducción de secuencias de ARN y las secuencias de ARN se transcriben a partir de secuencias de ADN. Las proteínas llevan a cabo muchas funciones clave en una célula, por lo que la transcripción y la traducción controlan muchos de los comportamientos y rasgos celulares y rsquos. No es sorprendente, entonces, que la transcripción y la traducción se hayan estudiado extensamente, y se conozcan muchos de los componentes centrales que son necesarios y suficientes para la expresión génica controlada (Figura 7-3).

Figura 7-3. Representación simbólica de una unidad de expresión genética. La secuencia promotora, representada por la flecha de la izquierda, se une a la ARN polimerasa para iniciar la transcripción. El sitio de unión al ribosoma, abreviado como & ldquoRBS & rdquo y representado por un semicírculo, es una secuencia de ADN que codifica el segmento de ARNm donde el ribosoma se une para iniciar la traducción. El marco de lectura abierto, abreviado & ldquoORF & rdquo y representado por la flecha a la derecha representa una secuencia de ADN que codifica una proteína. La dirección de las flechas para el promotor y el ORF indican la dirección en la que se leen.

Para transcripción, promotores son las secuencias de ADN que se unen a la ARN polimerasa, una enzima multiproteína compleja, para iniciar la formación de cadenas de ARN a partir de la plantilla de ADN. Para la traducción, el sitio de iniciación se denominasitio de unión al ribosoma (RBS) porque el ribosoma reconoce esta secuencia para comenzar la síntesis de proteínas a partir de la plantilla de ARN. Estas secuencias son en gran parte responsables de la regulación natural de la transcripción y la traducción, y los biólogos sintéticos también pueden utilizarlas para introducir sus propios esquemas de regulación. Basándose en las numerosas secuencias de promotores y RBS conocidas, los investigadores han identificado una secuencia de consenso para estas partes, como se demuestra en Figura 7-4. La secuencia promotora consenso, por ejemplo, se ha determinado mediante una comparación de los nucleótidos en cada posición en muchas secuencias promotoras. El consenso se construye a partir del patrón de nucleótidos que se encuentra con mayor frecuencia en cada posición.

Figura 7-4. Definición de secuencias de consenso. Se alinean múltiples & ldquosecuencias & rdquo para una oración (izquierda) y un gen (derecha) para generar una secuencia de consenso, que se muestra en la línea inferior en gris. Las letras de color verde representan la letra más común en cada posición, que define la secuencia de consenso. Las letras en rojo no son las letras más comunes en esa posición y, por lo tanto, no se incluyen en la secuencia de consenso.

Las secuencias de consenso son relevantes para la biología sintética porque, en términos generales, una parte funciona mejor cuando se corresponde con la secuencia de consenso. Por el contrario, cuantos más nucleótidos difieran de la secuencia de consenso, menos capaz esa parte puede hacer su trabajo. Por lo tanto, una secuencia promotora de consenso es probablemente un promotor & ldquostrong, lo que significa que probablemente se unirá bien a la ARN polimerasa e iniciará la transcripción con frecuencia, mientras que una secuencia promotora o RBS que se desvíe del consenso será & ldquoweak, & rdquo haciendo su trabajo de manera menos eficiente que una secuencia con mejores partidos. Sin embargo, fuerte no significa necesariamente mejor. Dependiendo de la aplicación, un ingeniero podría querer solo un pequeño nivel de actividad, si, por ejemplo, se estuviera haciendo un poro en la superficie de la célula o si se estuviera regulando una respuesta de muerte celular.

El Lac Operon

La capacidad de una célula para activar y desactivar productos genéticos según sea necesario es fundamental para su supervivencia. En la década de 1960, el Dr. Francois Jacob y el Dr. Jacques Monod identificaron los principios fundamentales de la expresión génica a través de sus estudios sobre el transporte y el metabolismo de la lactosa en las bacterias. Los genes del metabolismo de la lactosa se agrupan en el operón lac (Figura 7-5), pero las bacterias conservan energía activando estos genes solo cuando no hay glucosa.Las bacterias prefieren la glucosa como fuente de alimento y solo harán el esfuerzo de utilizar lactosa si su alimento preferido está ausente. Los detalles moleculares en la explicación de Jacob y Monod & rsquos para su regulación son un modelo clásico de gen inducible. Aquí solo discutimos los detalles relevantes para el laboratorio de dispositivos iTune.

Figura 7-5. Representación simbólica del operón lac. El operón lac consta de un solo promotor (pLac, flecha verde) que controla tres pares de RBS y ndashORF aguas abajo (semicírculos verdes y flechas azules, respectivamente). El operón produce las enzimas necesarias para metabolizar los azúcares solo cuando no hay glucosa presente.

La proteína clave para el metabolismo de la lactosa es una enzima llamada & beta-galactosidasa, a menudo abreviada como & beta-gal, y está codificada en el ADN por el ORF llamado lacZ. La enzima & beta-gal escinde la lactosa en glucosa y galactosa, que pueden ser utilizadas por la célula para potenciar sus otras funciones. Los investigadores también han descubierto que & beta-gal reacciona con una variedad de moléculas similares a la lactosa, incluidos análogos sintéticos como ONPG, que utilizará en el laboratorio de dispositivos iTune.

La expresión de LacZ, y la de todo el operón lac, está regulada tanto positiva como negativamente a nivel transcripcional (Figura 7-6). Regulación positiva ocurre cuando una proteína de unión al ADN aumenta la cantidad de transcripción a través de elementos de ADN aguas abajo de su sitio de unión al ADN. En cambio, regulación negativa es el término utilizado para describir el caso en el que las proteínas de unión al ADN reducen la cantidad de transcripción cuando se unen al ADN. Para el operón lac, los factores reguladores positivos y negativos son sensibles al tipo de azúcar en el ambiente de bacterias y rsquos. Cuando la glucosa está presente, los factores reguladores desactivan la transcripción de los ORF posteriores. Si la lactosa está presente y la glucosa está ausente, esos mismos factores reguladores de la transcripción cambian sus comportamientos y la transcripción del operón conduce al transporte y metabolismo de la lactosa.

El mismo promotor regulado positiva y negativamente que controla lacZ también controla los otros genes del operón lac, incluido el que codifica la proteína de transporte de lactosa. Un solo ARNm se transcribe a partir del operón lac y el promotor rsquos, dando lugar a los múltiples productos proteicos necesarios para el metabolismo y transporte de la lactosa. La traducción de cada producto puede ocurrir a partir del ARNm único gracias a las RBS que están asociadas con cada ORF. Es una arquitectura genética compacta y elegante que la naturaleza ha ajustado para producir las cantidades necesarias de cada proteína cuando sea apropiado.

Figura 7-6. Regulación del operón lac. El ORF lacI codifica un represor transcripcional que bloquea el Placa promotor y por lo tanto bloquea la expresión de todo el operón. La lactosa, o su análogo IPTG, inhibe la proteína represora LacI, permitiendo que la Placa promotor para funcionar y aliviar la inhibición del operón corriente abajo.

Lectura y recursos adicionales

& secta Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinamiento y estandarización de partes y dispositivos biológicos sintéticos. Biotecnología de la naturaleza 2008 26:787-93.

& secta Jacob F., Monod J. Mecanismos reguladores genéticos en la síntesis de proteínas. JMB. 19613:318-56.

& secta Kelly, J.R. et al. Medición de la actividad de los promotores de BioBrick utilizando un estándar de referencia in vivo. Revista de Ingeniería Biológica (2009)3:4.

& secta McFarland, J. Nefelómetro: instrumento para estimar el número de bacterias en suspensiones utilizado para calcular el índice opsónico y para vacunas. JAMA. 190714:1176-8.

y secta Miller, J.H. Experimentos en Genética Molecular Cold Spring Harbor 1972 Prensa de laboratorio de Cold Spring Harbor.

y secta Salis, S.M. La calculadora del sitio de unión del ribosoma. Métodos Enzymol. 2011498:19-42.

& sitio web de la secta: Registro de Partes Biológicas (http://parts.igem.org/Main_Page).

Laboratorio de dispositivos iTune

Este laboratorio se centra en las proteínas y secuencias de ADN necesarias para expresar un gen (promotores, ORF, ARN polimerasa, etc.) y también sirve como introducción a la enzimología básica. Los conceptos de ingeniería de modularidad, aislamiento y medición se exploran mediante el análisis de nueve diseños de regulación genética. Cada diseño tiene una combinación única de promotor y RBS que controla la expresión de una enzima, beta-galactosidasa. El análisis espectrofotométrico y los ensayos cinéticos enzimáticos son las principales habilidades biotecnológicas que se enfatizan en este laboratorio.

Opciones de diseño

En contraste con el operón lac que ocurre naturalmente, las arquitecturas genéticas de los circuitos de genes del dispositivo iTune son estructuras más simples, con un promotor y un RBS controlando un ORF (ver Figura 7-7). Para aliviar cualquier impacto de estos factores reguladores positivos y negativos en las mediciones del dispositivo iTune, las células se cultivan en medios ricos pero sin la proteína reguladora positiva celular y rsquos, y en presencia de IPTG, una molécula que inhibe la proteína reguladora negativa. Podemos personalizar el comportamiento de los circuitos de iTune debido a los comportamientos modulares de cada parte del ADN. Como Jacob y Monod describieron para E. coli& rsquos natural lac operón, el dispositivo iTune & rsquos partes tienen funciones discretas y características de rendimiento, que los biólogos sintéticos utilizan en su beneficio para el biodiseño.

Figura 7-7. Modificación del operón lac. A los constructos genéticos, como los que se estudian en la actividad del dispositivo iTune, se les eliminan el segundo y tercer par RBS-ORF. La unidad de expresión génica resultante lleva un solo promotor-RBS-ORF.

Pregunta experimental

En el laboratorio del dispositivo BioBuilder iTune, medirá la actividad del producto del gen lacZ, & beta-gal, para evaluar el rendimiento de diferentes combinaciones de promotor y RBS. El promotor y las partes de RBS se han caracterizado como & ldquoweak, & rdquo & ldquomedium, & rdquo o & ldquostrong, & rdquo en función de su alineación con las secuencias de consenso para dichas partes. Sin embargo, la forma en que funcionarán en combinación puede depender de los medios de cultivo, los antecedentes de la cepa y las técnicas para evaluarlos. Si tiene tiempo o interés, puede realizar estas mediciones en diferentes cepas bacterianas, en cepas en diferentes etapas de crecimiento o con circuitos de ADN adicionales en el sistema vivo. Cualquiera de estos factores podría alterar el funcionamiento de estos circuitos promotores simples: RBS: lacZ en la célula.

¿Qué podría predecir sobre la actividad de estos circuitos antes de ejecutar el laboratorio para medirlos? Tabla 7-2 puede ayudar a organizar sus & ldquoguestimates & rdquo, así como revelar cualquier sesgo en su pensamiento y lagunas en su comprensión. Si adivinamos arbitrariamente que la combinación de un promotor débil y un RBS débil dará lugar a 10 unidades, y la combinación fuerte / fuerte dará lugar a 1,000 unidades, ¿cómo podemos estimar todo lo que hay en el medio? Los valores iniciales en la tabla son teóricos y pueden no reflejar los números que obtiene para estos circuitos cuando ejecuta este experimento. El punto es preguntar qué se necesita para hacer una buena predicción.


1 *. transcripción (activar / reprimir)2. Procesamiento de ARN (empalme alternativo)3. Transporte de ARNm (atascado en el núcleo = degradado)4 *. Traducción de ARNm (tasa y reinicio del amperio: 5'cap / cola poliA)5. Degradación del ARNm (cola larga de poliA = vida más larga)6. Actividad / degradación de proteínas (modificación posterior a la traducción)

CIS - SECUENCIA DE MEJORADOR EN EL ADN (regulatorio)

TRANS- Una PROTEÍNA ACTIVADORA ENLACE LA SECUENCIA CIS

Elementos CIS = secuencia de ADN reguladora. donde los TF se unen
--- es decir: (promotores / potenciadores)

Proteínas reguladoras de genes TRANS que reconocen elementos cis.
---- es decir: (TFIID, activadores)


Biotecnología láctea

Todas las funciones metabólicas en una célula con respecto a las rutas degradativas y biosintéticas en procariotas y eucariotas se realizan a través de la expresión de genes específicos codificados en su ADN para el crecimiento y desarrollo. Sin embargo, no todos los genes presentes en una célula se expresan todo el tiempo a menos que sus funciones sean absolutamente indispensables. La mayoría de los genes se activan solo cuando los productos de dichos genes son necesarios para el crecimiento en un entorno determinado (señal). Su expresión se apaga cuando sus productos ya no son necesarios o la célula ya tiene cantidades adecuadas de estos productos. Esta activación y desactivación de la expresión génica en una célula constituye un sistema muy poderoso y estrictamente regulado para controlar la funcionalidad de los genes. Al apagar la expresión de genes cuando sus productos no son necesarios, un organismo puede evitar un desperdicio innecesario de energía, ya que los recursos energéticos disponibles en una célula son limitados. La célula tiene que utilizar los recursos energéticos conservados de manera muy juiciosa para sintetizar productos que maximicen la tasa de crecimiento celular. La expresión génica en una población bacteriana está regulada principalmente por tres mecanismos, es decir, sistemas constitutivos, inducibles y reprimibles que operan en estos organismos.

7.2 Expresión constitutiva

La expresión de genes constitutivos no está regulada, lo que es típico de genes cuyos productos son indispensables para las funciones celulares. Estos genes siempre permanecen activados y siguen produciendo las enzimas o proteínas deseadas de forma continua y estable todo el tiempo para el crecimiento y la supervivencia de la célula. Dichos genes se denominan genes constitutivos o de mantenimiento que codifican ARN y proteínas que tienen funciones vitales basales como ARNr, proteínas ribosomales y enzimas glucolíticas / respiratorias.

7.3 Genes inducibles y reprimibles

Los productos génicos inducibles y reprimibles se requieren solo en determinadas circunstancias. Los genes inducibles se "encienden" en respuesta a la presencia de un sustrato (inductor) en el entorno, p. Ej. lactosa en el operón lac.

Los genes reprimibles se "desactivan" en respuesta a una señal ambiental, p. Ej. la presencia simultánea de lactosa / glucosa o xilosa / glucosa que reprimirá los genes necesarios para la utilización de lactosa o xilosa.

7.4 Regulación negativa y positiva de la expresión genética

Las bacterias alteran la expresión génica mediante el uso de regulación positiva o negativa. La diferencia fundamental entre la regulación positiva y negativa es cuando la molécula reguladora, es decir, el represor solo (operón lac) o el represor junto con el inductor / producto final ('operón trp') se une al promotor y también si la molécula aumenta (inductor) o disminuye. (represor) la expresión génica.

La expresión de genes procariotas está estrictamente regulada a nivel de funciones de transcripción, traducción y enzimas. Dado que la transcripción y la traducción están acopladas en procariotas, el nivel de control en la expresión génica es relativamente más alto a nivel transcripcional.


Un operón constituye un interruptor genético que opera en procariotas solo para regular coordinadamente un grupo de genes involucrados en las vías metabólicas (degradantes y biosintéticas) para su funcionalidad. Estos genes se transcriben juntos bajo el control del mismo promotor en un solo ARNm policistrónico que finalmente se traduce en sus polipéptidos individuales. El operón consta de tres elementos básicos: los genes estructurales, a saber, las secuencias reguladoras. regiones promotoras y operadoras y el gen regulador. El ejemplo más conocido del sistema de operón es el "operón lac" en E. coli, que ahora se utiliza ampliamente como modelo para comprender el mecanismo de utilización de la lactosa en las bacterias.


Un operón es una unidad funcional de expresión génica en bacterias. Esto representa el sistema regulador de genes único que opera solo en procariotas. El modelo del "operón lac" fue propuesto por Jacob y Monod en 1961 para describir la regulación coordinada de genes que codifican enzimas requeridas para la utilización de lactosa en E. coli.

7.6.1 Elementos del "operón lac"

El "operón lac" consta de los siguientes elementos clave, como se muestra en la figura 7.1.

7.6.1.1 Tres genes estructurales

El "operón Lac" se compone de tres genes estructurales, a saber. lacZ, lacY y lacA que codifican enzimas / proteínas que están relacionadas funcionalmente para provocar el metabolismo de la lactosa en E. coli. Todos estos tres genes están bajo el control de un solo promotor y participan en la descomposición de la lactosa.

i) LacZ codifica la β-galactosidasa que descompone la lactosa en glucosa y galactosa.

ii) Códigos LacY para la lactosa permeasa necesarios para el transporte de lactosa a las células de E. coli.

iii) Códigos LacA para tiogalactósido transacetilasa cuya función precisa no se conoce todavía.


7.6.1.2 Secuencias reglamentarias

Las secuencias reguladoras del "operón lac" incluyen las siguientes.

i) LacO: la región del operador (O) en la que se une el represor "lac" para bloquear el promotor de la unión de la ARN polimerasa, desactivando así el "operón lac".

ii) LacP: la región promotora (P) en la que se une la ARN polimerasa para iniciar la transcripción de los genes estructurales en ARNm policistrónico.

iii) LacI: el gen regulador que codifica la proteína represora "lac" que actúa en trans y que se une a la región del operador para bloquear la transcripción en ausencia de lactosa, el inductor del operón lac. De hecho, el inductor real del operón lac es la alolactosa, un isómero de la lactosa.

iv) LacI no se encuentra dentro del operón lac, sino varios nucleótidos cadena arriba del operón lac junto con su propio promotor para sintetizar el represor "lac".

Aparte de estos, hay algunas moléculas efectoras que activan o desactivan la unión del represor o ARN polimerasa a sus respectivos sitios en las regiones promotor-operador del operón lac. La organización del "operón lac" y su funcionamiento en la regulación de los genes estructurales necesarios para el metabolismo de la lactosa en E. coli se ilustran esquemáticamente a continuación.

El operón lac se regula de manera diferente en presencia o ausencia del inductor, es decir, lactosa (alolactosa) como se describe a continuación.

7.7.1 En ausencia de lactosa

Cuando la lactosa está ausente del medio de crecimiento inoculado con E. coli, el represor lac se sintetiza expresando lacI de su promotor con la ayuda de la ARN polimerasa en forma activa y se difunde en el medio para alcanzar el sitio del operador en el operón. La unión del represor al operador bloquea la unión de la ARN polimerasa al promotor y, por lo tanto, los genes estructurales se desactivan y, por lo tanto, el operón no sintetiza el ARNm policistrónico. En la figura 7.2 se muestra la regulación del "operón lac" en ausencia de inductor, es decir, lactosa.

7.7.2 En presencia de lactosa

Cuando la lactosa está disponible en el medio de crecimiento, se unirá al represor en su sitio de unión inductor y altera la conformación del represor que ya no puede unirse con el sitio operador en el operón lac. Por lo tanto, no hay ningún obstáculo en la unión de la ARN polimerasa en el promotor y, por lo tanto, los tres genes estructurales se transcriben en un ARNm policistrónico a partir del cual las tres enzimas necesarias para el metabolismo de la lactosa se traducen de forma independiente para realizar sus funciones específicas. En la figura 7.3 se muestra la regulación del "operón lac" en presencia de un inductor, es decir, lactosa.

De hecho, el inductor real del operón lac no es la lactosa, sino su isómero alolactosa, que se produce a partir de lactosa con la ayuda de la β-galactosidasa. Sin embargo, la principal limitación de la lactosa (alolactosa) que actúa como inductor cuando se agrega en el medio es su utilización constante por E. coli durante el crecimiento y, por lo tanto, debe reponerse continuamente para mantener en marcha la inducción del operón lac. Este problema se ha resuelto en gran medida con la síntesis de IPTG (isopropil tio galactósido), un análogo estructural de lactosa, un inductor gratuito del operón lac que actúa como un inductor artificial eficaz sin ser metabolizado por la bacteria y, por lo tanto, permanece allí. en el medio de crecimiento indefinidamente. El IPTG se usa ampliamente en el laboratorio para inducir la expresión de genes heterólogos en E. coli para la producción a gran escala de proteínas recombinantes de alto valor.

7.7.3 El operón Lac está bajo regulación tanto negativa como positiva

El operón Lac es un ejemplo clásico de un operón que está sujeto a regulación tanto negativa como positiva. La regulación negativa, como ya se mencionó, está mediada por la molécula represora que se unirá al operador en ausencia del inductor y, por lo tanto, desactivará los genes estructurales al inhibir su transcripción. La regulación positiva del operón lac es desencadenada por una molécula de señal llamada cAMP (monofosfato de adenosina cíclico) que detecta el agotamiento de la concentración de glucosa en el medio (cuando las células de E. coli están en condiciones de inanición). En concentraciones elevadas de glucosa en el medio, el nivel de cAMP en la célula desciende y, a la inversa, en concentraciones bajas de glucosa, aumenta el nivel de cAMP en la célula. AMPc activa otra proteína llamada CRP (proteína receptora de AMPc) también designada como CAP (proteína activadora de catabolitos) que se unirá al sitio CRP en el operón lac ubicado cerca del promotor lac solo cuando esté complejado con AMPc. La unión de la CRP activa fortalecerá la unión de la ARN polimerasa en el promotor, aumentando así considerablemente la expresión del operón lac. El funcionamiento de la regulación positiva del "operón lac" se ha demostrado en la figura 7.4.

Otras lecturas

Genética bacteriana fundamental, Nancy Trun, Janine Trempy (Eds), Wiley-Blackwell, 2003, ISBN: 978-0-632-04448-1

From Genes to Genomes: Concepts and Applications of DNA Technology, 3 rd Edition, Jeremy W. Dale, Malcolm von Schantz, Nicholas Plant (Eds), Wiley-Blackwell, 2011, ISBN: 978-0-470-68386-6

Genética microbiana, 2ª edición, Stanly R Maloy, John Cronan, David Freifelder, Narosa, ISBN: 8173196974

Biología molecular del gen, sexta edición, James D. Watson (Editor) Cold Spring Harbor Press y Benjamin Cummings, ISBN 978-080539592-1


BIOTECNOLOGÍA LÁCTEA

Todas las funciones metabólicas en una célula con respecto a las rutas degradativas y biosintéticas en procariotas y eucariotas se realizan a través de la expresión de genes específicos codificados en su ADN para el crecimiento y desarrollo. Sin embargo, no todos los genes presentes en una célula se expresan todo el tiempo a menos que sus funciones sean absolutamente indispensables. La mayoría de los genes se activan solo cuando los productos de dichos genes son necesarios para el crecimiento en un entorno determinado (señal). Su expresión se apaga cuando sus productos ya no son necesarios o la célula ya tiene cantidades adecuadas de estos productos. Esta activación y desactivación de la expresión génica en una célula constituye un sistema muy poderoso y estrictamente regulado para controlar la funcionalidad de los genes. Al desactivar la expresión de genes cuando sus productos no son necesarios, un organismo puede evitar un desperdicio innecesario de energía, ya que los recursos energéticos disponibles en una célula son limitados. La célula tiene que utilizar los recursos energéticos conservados de manera muy juiciosa para sintetizar productos que maximicen la tasa de crecimiento celular. La expresión génica en una población bacteriana está regulada principalmente por tres mecanismos, es decir,sistemas constitutivos, inducibles y reprimibles que operan en estos organismos.

7.2 Expresión constitutiva

La expresión de genes constitutivos no está regulada, lo que es típico de genes cuyos productos son indispensables para las funciones celulares. Estos genes siempre permanecen activados y siguen produciendo las enzimas o proteínas deseadas de forma continua y estable todo el tiempo para el crecimiento y la supervivencia de la célula. Dichos genes se denominan genes constitutivos o de mantenimiento que codifican ARN y proteínas que tienen funciones vitales basales como ARNr, proteínas ribosomales y enzimas glucolíticas / respiratorias.

7.3 Genes inducibles y reprimibles

Los productos génicos inducibles y reprimibles se requieren solo en determinadas circunstancias. Los genes inducibles se "encienden" en respuesta a la presencia de un sustrato (inductor) en el entorno, p. Ej. lactosa en el operón lac.

Los genes reprimibles se "desactivan" en respuesta a una señal ambiental, p. Ej. la presencia simultánea de lactosa / glucosa o xilosa / glucosa que reprimirá los genes necesarios para la utilización de lactosa o xilosa.

7.4 Regulación negativa y positiva de la expresión genética

Las bacterias alteran la expresión génica mediante el uso de regulación positiva o negativa. La diferencia fundamental entre la regulación positiva y negativa es cuando la molécula reguladora, es decir, el represor solo (operón lac) o el represor junto con el inductor / producto final ('operón trp') se une al promotor y también si la molécula aumenta (inductor) o disminuye. (represor) la expresión génica.

La expresión de genes procariotas está estrictamente regulada a nivel de funciones de transcripción, traducción y enzimas. Dado que la transcripción y la traducción están acopladas en procariotas, el nivel de control en la expresión génica es relativamente más alto a nivel transcripcional.


Un operón constituye un interruptor genético que opera en procariotas solo para regular coordinadamente un grupo de genes involucrados en las vías metabólicas (degradantes y biosintéticas) para su funcionalidad. Estos genes se transcriben juntos bajo el control del mismo promotor en un solo ARNm policistrónico que finalmente se traduce en sus polipéptidos individuales. El operón consta de tres elementos básicos: los genes estructurales, a saber, las secuencias reguladoras. regiones promotoras y operadoras y el gen regulador. El ejemplo más conocido del sistema de operón es el "operón lac" en E. coli, que ahora se utiliza ampliamente como modelo para comprender el mecanismo de utilización de la lactosa en las bacterias.


Un operón es una unidad funcional de expresión génica en bacterias. Esto representa el sistema regulador de genes único que opera solo en procariotas. El modelo del "operón lac" fue propuesto por Jacob y Monod en 1961 para describir la regulación coordinada de genes que codifican enzimas requeridas para la utilización de lactosa en E. coli.

7.6.1 Elementos del "operón lac"

El "operón lac" consta de los siguientes elementos clave, como se muestra en la figura 7.1.

7.6.1.1 Tres genes estructurales

El "operón Lac" se compone de tres genes estructurales, a saber. lacZ, lacY y lacA que codifican enzimas / proteínas que están relacionadas funcionalmente para provocar el metabolismo de la lactosa en E. coli. Todos estos tres genes están bajo el control de un solo promotor y participan en la descomposición de la lactosa.

i) LacZ codifica la β-galactosidasa que descompone la lactosa en glucosa y galactosa.

ii) Códigos LacY para la lactosa permeasa necesarios para el transporte de lactosa a las células de E. coli.

iii) Códigos LacA para tiogalactósido transacetilasa cuya función precisa no se conoce todavía.


7.6.1.2 Secuencias reglamentarias

Las secuencias reguladoras del "operón lac" incluyen las siguientes.

i) LacO: la región del operador (O) en la que se une el represor "lac" para bloquear el promotor de la unión de la ARN polimerasa, desactivando así el "operón lac".

ii) LacP: la región promotora (P) en la que se une la ARN polimerasa para iniciar la transcripción de los genes estructurales en ARNm policistrónico.

iii) LacI: el gen regulador que codifica la proteína represora "lac" que actúa en trans y que se une a la región del operador para bloquear la transcripción en ausencia de lactosa, el inductor del operón lac. De hecho, el inductor real del operón lac es la alolactosa, un isómero de la lactosa.

iv) LacI no se encuentra dentro del operón lac, sino varios nucleótidos cadena arriba del operón lac junto con su propio promotor para sintetizar el represor "lac".

Aparte de estos, hay algunas moléculas efectoras que activan o desactivan la unión del represor o ARN polimerasa a sus respectivos sitios en las regiones promotor-operador del operón lac. La organización del "operón lac" y su funcionamiento en la regulación de los genes estructurales necesarios para el metabolismo de la lactosa en E. coli se ilustran esquemáticamente a continuación.

El operón lac se regula de manera diferente en presencia o ausencia del inductor, es decir, lactosa (alolactosa) como se describe a continuación.

7.7.1 En ausencia de lactosa

Cuando la lactosa está ausente del medio de crecimiento inoculado con E. coli, el represor lac se sintetiza expresando lacI de su promotor con la ayuda de la ARN polimerasa en forma activa y se difunde en el medio para alcanzar el sitio del operador en el operón. La unión del represor al operador bloquea la unión de la ARN polimerasa al promotor y, por lo tanto, los genes estructurales se desactivan y, por lo tanto, el operón no sintetiza el ARNm policistrónico. En la figura 7.2 se muestra la regulación del "operón lac" en ausencia de inductor, es decir, lactosa.

7.7.2 En presencia de lactosa

Cuando la lactosa está disponible en el medio de crecimiento, se unirá al represor en su sitio de unión inductor y altera la conformación del represor que ya no puede unirse con el sitio operador en el operón lac. Por lo tanto, no hay ningún obstáculo en la unión de la ARN polimerasa en el promotor y, por lo tanto, los tres genes estructurales se transcriben en un ARNm policistrónico a partir del cual las tres enzimas necesarias para el metabolismo de la lactosa se traducen de forma independiente para realizar sus funciones específicas. En la figura 7.3 se muestra la regulación del "operón lac" en presencia de un inductor, es decir, lactosa.

De hecho, el inductor real del operón lac no es la lactosa, sino su isómero alolactosa, que se produce a partir de lactosa con la ayuda de la β-galactosidasa. Sin embargo, la principal limitación de la lactosa (alolactosa) que actúa como inductor cuando se agrega en el medio es su utilización constante por E. coli durante el crecimiento y, por lo tanto, debe reponerse continuamente para mantener en marcha la inducción del operón lac. Este problema se ha resuelto en gran medida con la síntesis de IPTG (isopropil tio galactósido), un análogo estructural de lactosa, un inductor gratuito del operón lac que actúa como un inductor artificial eficaz sin ser metabolizado por la bacteria y, por lo tanto, permanece allí. en el medio de crecimiento indefinidamente. El IPTG se usa ampliamente en el laboratorio para inducir la expresión de genes heterólogos en E. coli para la producción a gran escala de proteínas recombinantes de alto valor.

7.7.3 El operón Lac está bajo regulación tanto negativa como positiva

El operón Lac es un ejemplo clásico de un operón que está sujeto a regulación tanto negativa como positiva. La regulación negativa, como ya se mencionó, está mediada por la molécula represora que se unirá al operador en ausencia del inductor y, por lo tanto, desactivará los genes estructurales al inhibir su transcripción. La regulación positiva del operón lac es desencadenada por una molécula de señal llamada cAMP (monofosfato de adenosina cíclico) que detecta el agotamiento de la concentración de glucosa en el medio (cuando las células de E. coli están en condiciones de inanición). En concentraciones elevadas de glucosa en el medio, el nivel de cAMP en la célula desciende y, a la inversa, en concentraciones bajas de glucosa, aumenta el nivel de cAMP en la célula. AMPc activa otra proteína llamada CRP (proteína receptora de AMPc) también designada como CAP (proteína activadora de catabolitos) que se unirá al sitio CRP en el operón lac ubicado cerca del promotor lac solo cuando esté complejado con AMPc. La unión de la CRP activa fortalecerá la unión de la ARN polimerasa en el promotor, aumentando así considerablemente la expresión del operón lac. El funcionamiento de la regulación positiva del "operón lac" se ha demostrado en la figura 7.4.

Otras lecturas

Genética bacteriana fundamental, Nancy Trun, Janine Trempy (Eds), Wiley-Blackwell, 2003, ISBN: 978-0-632-04448-1

From Genes to Genomes: Concepts and Applications of DNA Technology, 3 rd Edition, Jeremy W. Dale, Malcolm von Schantz, Nicholas Plant (Eds), Wiley-Blackwell, 2011, ISBN: 978-0-470-68386-6

Genética microbiana, 2ª edición, Stanly R Maloy, John Cronan, David Freifelder, Narosa, ISBN: 8173196974

Biología molecular del gen, sexta edición, James D. Watson (Editor) Cold Spring Harbor Press y Benjamin Cummings, ISBN 978-080539592-1


Examen 2 Lesión tisular y defensa del anfitrión

1) La curva de crecimiento será diferente:
Fase de retraso - & gt exponencial - & gt estacionaria - & gt EXPONENCIAL OTRA VEZ (en comparación con si solo se le dio una sola fuente de carbono, por ejemplo, glucosa, después de estacionaria se vería que la curva de crecimiento bacteriano bajaba porque se agota el nutriente, lo cual es normal).
- Lag Phase = btwn utilización de glucosa y amp "de lactosa, bc proteínas que necesitan digerir la lactosa necesitan ser" transcritas "/ creadas.
- PLATEAU en lactosa porque se necesita algo de tiempo para que la lactosa ingrese y la inducción de enzimas.

E. Coli usa glucosa primero, luego lactosa (cuando ambos están presentes):
1) Cuando hay glucosa, se inhibe el transporte de lactosa al interior de la célula.
ENZIMA II (para glucosa) NO ES FOSFORILADA.
Lac Permease no es funcional
2) Cuando hay glucosa, la transcripción de "enzimas metabolizadoras de lactosa" está "reprimida".
Enzima II (para glucosa) no fosforilada.
NO alolactosa (no se puede inducir en la célula - "Exclusión del inductor"), por lo que el "represor de laca" permanece en el operador y NO transcripción de las enzimas que metabolizan la lactosa. [normalmente, cuando la lactosa está presente, la alolactosa se unirá al Repressor (gen Lac I) / lo desplazará, de modo que el ARN pueda llegar a donde estaba y realizar la transcripción de los genes que metabolizan la lactosa].
3) Cuando hay glucosa presente, la Regulación Positiva (activación de la transcripción) por CAP del "operón lac" está INACTIVADA. (inactivación del regulador positivo)!
Enzima II (para glucosa) no fosforilada.
no puede interactuar y activar la adenilato ciclasa - & gt no hay producción de AMP cíclico - & gt no hay complejo CAP-cAMP = proteína CAP NO ACTIVA y NO PUEDE unirse (los reguladores positivos se unen corriente arriba del promotor a muchos genes / lugares) al ADN para activar transcripcionalmente el operón lac . [nota: CAP debe ser con amp cíclico para unirse al ADN, no puede hacerlo solo y el cAMP está hecho de ATP (sepa esto) a través de la enzima adenilato ciclasa que se encuentra en la membrana].

2) Lac Permease = inactivo [EXCLUSIÓN DEL INDUCTOR] (ambos presentes), activo (solo lactosa).

3) Lac Repressor = Activo [REGULACIÓN NEGATIVA] (ambos presentes) Inactivo (solo lactosa).

4) Adenilato ciclasa, producción de AMPc = Inactivo / bajo (ambos presentes) activo / alto (solo lactosa)

5) Complejo CAP-cAMP = Inactivo (ambos presentes) activo [REGULACIÓN POSITIVA] (solo lactosa)

6) Expresión del operón Lac = Desactivado (ambos presentes) Activado (solo lactosa).

1. Activo Lac Repressor & lt - alolactosa - & gt inactive & quot & quot.
2. Activador CAP activo & lt ---- cAMP --- & gt inactivo.
3. Activo represor CcpA & lt --- Fructosa-1,6-BP ---- & gt inactivo.

1) Crecimiento aeróbico, aceptor e = oxígeno =
la citocromo oxidasa produce H2O

2) Crecimiento anaeróbico, e-aceptor orgánico = fumarato o nitrato = fumarato reductasa produce succinato, nitrato reductasa produce amoníaco.

FNR = es el regulador clave de la respiración. Funciona anaeróbicamente como activador y represor

PAG
D. La actividad de la adenilato ciclasa está regulada por oxidación.
E. Todo lo anterior

Fagocito = definido por su función también conocida como
ingiriendo partículas [forma de cremallera] = la estructura tiene un montón de receptores en la superficie y tiene orgánulos internos.

Macrófagos:
- Larga vida
- Presente en tejidos (cuando madura)
- Matanza dependiente de O2 no vigorosa
- Condiciones susceptibles de
crecimiento intracelular de patógenos
- Tácticas de patógenos en la batalla =
a) Evitar estallido respiratorio
b) Salir del fagosoma
c) Prevenir la fusión de fagolisosomas
d) Resiste el contenido de gránulos

Tipos de receptores implicados en la fagocitosis:
1) LOS RECEPTORES FAGOCÍTICOS definen qué es la célula fagocítica
1a) "RECEPTORES DE COMPLEMENTO" que reconocen las proteínas positivas del COMPONENTE DEL COMPLEMENTO en suero en la superficie de los patógenos.
- 3 PAPELES DE LOS COMPONENTES DEL COMPLEMENTO = Lisis de bacterias, quimiotaxis de fagocitos, opsonización de bacterias [importante para esta clase]
1b) Receptores Fc: en los fagocitos, se une a la región constante del anticuerpo.
1c) Lectinas = reconocimiento directo de carbohidratos específicos. un receptor específico. ADV: no se requiere inmunidad adquirida y activación de la cascada del complemento, pero ... DISADV: El insecto necesita tener los carbohidratos correctos en la superficie. Las DECTINAS son la clase principal de lectinas de fagocitos, participan en el reconocimiento de patógenos fúngicos. Tiene doble uso: también participa en la señalización inmune innata.

2) RECEPTORES DE ADHESIÓN: se movilizan en el tejido al pasar de la circulación al sitio de inflamación o también se mueven.

3) RECEPTORES DE ACTIVACIÓN: cambian la naturaleza de la célula fagocítica (hacen que sean más capaces de matar microorganismos = receptores tipo Toll, receptor Il-1, receptor TNF, receptor iFN gamma =
3a) "Macrófagos M1" tempranos = ACTIVACIÓN CLÁSICA (rojo) = (1) inflamación, (2) enfermedades bacterianas y virales. [ACTIVACIÓN CLÁSICA - & gt PROFESIONAL DENTAL].
- Propiedades de los fagocitos activados clásicamente (conozca estos):
1. Mayor tasa de fagocitosis
2. Mayor producción de oxígeno reactivo tóxico
intermedios (antimicrobianos)
3. Mayor producción de NO (óxido nítrico
antimicrobiano)
4. Fusión mejorada de fagosoma-lisosoma.
5. Mayor número de moléculas de MHC de clase II
6. Secreción de IL-12: diferenciación de linfocitos T CD4.
3b) Posterior - & quotM2 Macrófagos & quot = & quot; ACTIVACIÓN ALTERNATIVA (rojo) & quot = (1) No inflamatorio, (2) elimina el daño tisular, (3) A menudo, menos restrictivo de patógenos.

¿Qué conduce a ("causa") la opsonización? CUALQUIERA:

(1) Vía alternativa permite reconocer patógenos (superficie) en ausencia de anticuerpos = & gt activación del complemento = & gt reclutamiento de células inflamatorias + opsonización de patógenos + destrucción de patógenos.
- La Vía Alternativa comienza la opsonización escindiendo y depositando el fragmento C3 en la superficie del patógeno: opsonina - & gt La opsonización C3b es amplificada por una enzima.

(2) Opsonización por componente del complemento: Los componentes del complemento (reconocidos por los receptores del complemento, un tipo de receptor fagocítico) tienen tres funciones: (a) Lisis de bacterias, (b) Quimiotaxis de fagocitos, (c) Opsonización de bacterias.
- VENTAJAS DEL COMPLEMENTO = No necesita anticuerpos y puede reconocer una gran variedad de patógenos.

2) El suicidio por NADPH oxidasa libera antimicrobianos & quotNETS & quot; complejos de histonas de ADN que matan microorganismos (trampas en su interior); y las quothistonas asociadas con NETS son antimicrobianas & quot

3) Los mecanismos dependientes del oxígeno ocurren ANTES de la ingestión (ver otras fc)

2) Inhibir la opsonización o inactivar la fagocitosis
1. Cápsula: S. pneumoniae
2. Proteína M: S. pyogenes
3. Señalización interrumpida: proteínas RhoGAP
& quot Por ejemplo. Fagocito incapaz de ingerir estreptococos
pnuemoniae que lleva una cápsula & quot

¿Para qué sirve el daño? (¿Por qué los patógenos causan enfermedades?) =
1. Crea nuevos sitios de colonización,
2. Facilita la propagación en el anfitrión o de persona a persona
3. Genera nutrientes
4. Antagoniza las defensas del huésped.
[por ejemplo: Streptococcus pneumoniae secreta enzimas para penetrar la barrera epitelial nasofaríngea. También secreta factores que inhiben la fagocitosis (p. Ej., Neumolisina) y la función de los anticuerpos. Streptococcus pneumoniae = constituyente normal de la nasofaringe, enfermedad causada por diseminación a sitios distales. p.ej. Meningitis por Strep pneumonae - infarto cerebral inducido (desde la nasofaringe hasta el cerebro)]

- LOS PATÓGENOS CAUSAN DAÑOS A SUS HUÉSPEDES PARA PROMOVER EL CRECIMIENTO (EVITAR EL SISTEMA INMUNITARIO, CREAR NUEVOS SITIOS DE COLONIZACIÓN, GENERAR NUTRIENTES, FACILITAR LA PROPAGACIÓN).

- LOS PATÓGENOS CAUSAN DAÑOS, YA SEA DIRECTA (POR EJ. TOXINAS) O INDIRECTAMENTE, INDUCIENDO AL ANFITRIÓN QUE CAUSA DAÑO (POR EJ. INFLAMACIÓN, AUTOINMUNIDAD)

Endotoxina: componente lípido-azúcar de la envoltura celular de bacterias Gram-negativas que puede ser muy inmunoestimulante

Exotoxina: una toxina que se secreta en el medio extracelular (frente a la toxina inyectada por el sistema de secreción)
p.ej. Toxinas AB, enzimas degradativas

Enterotoxina: toxina que actúa en el tracto gastrointestinal.
p.ej. toxina del cólera

Neurotoxina: toxina que actúa en el sistema neural.
p.ej. tétanos y toxina botulínica

Mimetismo molecular: similitud antigénica entre antígenos producidos por patógenos y (auto) antígenos del huésped. Los anticuerpos o células T inducidos para reconocer el antígeno específico del patógeno reaccionan de forma cruzada con el autoantígeno (autoinmunidad).

TRES TIPOS DE TOXINAS:
(1) membrana activa (extracelular) = SUPERANTIGENS toxinas formadoras de poros.
(1a) aquellos que interfieren con la señalización celular:
SUPERANTIGENOS =: SEÑALIZACIÓN TCR (CELDA T). & amp CHOLERA TOXIN = señalización cAMP.
(1b) NEUROTOXINAS CLOSTRIDIALES =
TOXINA DEL TÉTANO (inhibe el tráfico celular)
TOXINA BOTULÍNICA

= TOXINAS ACTIVAS EN LA MEMBRANA (TSST-1) secretadas por un subconjunto de S. aureus ACTUAS EXTRACELULARMENTE que causan el SÍNDROME DE CHOQUE TÓXICO.

Los superantígenos causan ACTIVACIÓN DE CÉLULAS T NO ESPECÍFICA (independiente del antígeno) (2-20%) = proliferación masiva
LA INFLAMACIÓN EXCESIVA causa insuficiencia orgánica (choque tóxico)

= Blancos intracelulares (dentro de las celdas)
Problema: ¿cómo acceden estas toxinas a estos objetivos?
CÓMO LAS TOXINAS A-B RESUELVEN EL PROBLEMA DE PASAR A TRAVÉS DE LAS MEMBRANAS HOST:
1. TOXINA A-B SECRETADA POR BACTERIAS: ACTIVIDAD DE LA SUBUNIDAD A (DOMINIO ENZIMÁTICO).
2. SUBUNIDAD B: VINCULACIÓN A LOS RECEPTORES CELULARES
3. ENDOCITOSIS DE TOXINAS
4. TRASLADO Y LIBERACIÓN DE LA SUBUNIDAD A.

1. Subunidad B: se une a los gangliósidos y los antígenos del grupo sanguíneo = SUBUNIDAD B: SE UNE A LAS CÉLULAS EPITELIALES INTESTINALES.
2. Una subunidad: Sustrato de actividad ADP RIBOSILTRANSFERASA = adenilato ciclasa = A SUBUNIDAD: LA ACTIVIDAD ADP RIBOSILTRANSFERASA ALTERNA LA FUNCIÓN DEL TRANSPORTADOR QUE CONDUCE A LA SECRECIÓN MASIVA DE LÍQUIDO EN EL LÚMENO INTESTINAL.
3. Aumento de los niveles de AMP cíclico (cAMP)
a) Eflujo masivo de iones Cl- en el lumen
b) Inhibición de la absorción de Na + y Cl-

Neurotoxina botulínica (BoNT): ¿que es?

LAS TOXINAS DEL TÉTANO Y DEL BOTULINIO TIENEN _______ SIMILARES, PERO ___________ DIFERENTES.

Llévese a casa las neurotoxinas clostridiales = TOXINAS DE BOTULINIO Y TÉTANOS
- `` UNA SUBUNIDAD '' = HUELGA LOS COMPONENTES DE FUSIÓN DE LA MEMBRANA EN LAS NEURONAS Y ASÍ EVITA LA NEUROTRANSMISIÓN.
- & quotB SUBUNIT & quot = MUY SIMILAR

ESPECIFICIDAD VINCULANTE (NEURONAS) PARA AMBOS TIPOS DE TOXINAS.
- DIFERENTE: LAS TOXINAS B & ampT TIENEN & quot; EFECTOS OPUESTOS & quot [B = PARÁLISIS FLÁCIDA T = PARÁLISIS ESPÁSTICA] ACTO BC EN DIF. SITIOS (LOCALMENTE VS. SISTEMA NERVIOSO CENTRAL) .- TOXINA TETÁNICA (inhibe el tráfico celular)
TOXINA BOTULÍNICA

BOTULINUM NEUROTOXIN (BoNT) = BOTULUS RELAXANTE MUSCULAR = SALCHICHA nota: asoc. w Botox = tx para un tmd, tmj + migranes.

Células T CD4 + = expresan en la membrana una molécula llamada CD4 = RECONOCEN ÚNICAMENTE péptidos extraños presentados por MHC Clase 2 EXPRESADOS en APC [CD4 se une a MHC clase 2 (expresado en APC)]
- acción: MHC clase 2 más péptido expresado en APC (células dendríticas, macrófagos y células B - nota: estos también expresan MHC clase 1) interactúa con células T CD4 + = & gt SÍNTESIS DE CITOCINA.
- saber qué da lugar a la síntesis de citocinas.

Células T CD8 + = tienen CD8 en su membrana = solo reconocen péptidos extraños presentados por MHC Clase 1 EXPRESADO EN TODAS las células nucleadas. [CD8 se une al MHC de clase 1 (expresado en todas las células nucleadas].
- acción: el péptido MHC de clase 1 más expresado en cualquier célula nucleada interactúa con la célula T CD8 + = & gt da como resultado la MUERTE de la célula HOST.

MHC CLASE 2 = APC (CÉLULAS DENDRÍTICAS, MACRÓFAGOS, CÉLULAS B) = HLA-DP, DQ, DR (3 de mamá, 3 de papá) son la clase humana 2 = procesamiento de antígeno exógeno (fuera de la célula, flotando) = = tiene un RANURO DE UNIÓN DE PÉPTIDO (puede unir péptido y mhc todos juntos).

IMP - APC SON CÉLULAS NUCLEADAS - & gt TIENEN MHC1 Y MHC2 (¡AMBAS CLASES HUMANAS TAMBIÉN!).

1) Células dendríticas (DC)
2) Macrófagos (M0)
3) células B

2. INC. En el TAMAÑO de un órgano o tejido causado por un INC. En el NÚMERO de células (solo ocurre en células que pueden dividirse, por ejemplo, encías, neuronas y músculo cardíaco que no pueden dividirse)

3. DIC. en el TAMAÑO de un órgano o tejido resultante de una DISMINUCIÓN en la MASA de células preexistentes. (Resultados de: desuso, privación nutricional o de oxígeno, estimulación endocrina disminuida, envejecimiento, denervación) - Puede ser generalizada o localizada, patológica o fisiológica (común durante el desarrollo) Resultado de una disminución de la síntesis de proteínas y un aumento de la degradación de proteínas (responsable de la vía de ubiquitina)

4. DEC fisiológico. en el NÚMERO de celdas a su NÚMERO normal, ej. La glándula del timo involuciona durante la adolescencia (diferencia entre la niñez y la edad adulta), ej. El miometrio involuciona durante el posparto. = Forma de atrofia, Implica la apoptosis de las células.

5. Lipofuscina (Lipocromo) = PIGMENTO DE DESGASTE Y DESGASTE (comúnmente se acumula en pacientes ancianos, se encuentra con mayor frecuencia en hepatocitos, células miocárdicas y cerebro), ATROFIA MARRÓN (acumulación de lipofuscina y atrofia de los órganos. De color amarillento a marrón claro, pigmento soluble en grasa mezcla de lípidos / fosfolípidos y proteína signo de daño por radicales libres - p. ej. MÚSCULO ESTRIADO E HÍGADO.

6. Bilirrubina = Producto catabólico del grupo hemo de hemoglobina y mioglobina.
- condición patológica (Jauntice) = acumulación en sangre, esclerótica, mucosa, órganos. Decoloración amarilla. Ex. Ictericia hemolítica (destrucción de glóbulos rojos), ictericia obstructiva (destrucción intra / extrahepática del tracto biliar), ictericia hepatocelular (daño parenquimatoso del hígado).

NOTA: Las calcificaciones metastásicas ocurren en tejidos normales.

1. CONGESTIÓN - AUMENTAR EL FLUJO DE SANGRE DENTRO DE LOS VASOS VASOS DILADOS Y EMPAQUETADOS CON CÉLULAS DE SANGRE ROJAS (ERITROCITOS).

2. EDEMA - AUMENTE EL LÍQUIDO INTERSTICIAL CON UN ESPACIO AMPLIADO ENTRE LOS COMPONENTES INTERSTICIALES CAUSA HINCHAZÓN EXCEPTO EN LOS HUESOS

3. HEMORRAGIA - ACUMULACIÓN DE SANGRE FUERA DE LOS VASOS EXTRAVASACIÓN DE CÉLULAS ROJAS EN LOS TEJIDOS O EN LA SUPERFICIE EXTERNA

4. TROMBOSIS - COÁGULO DENTRO DE UN VASO DE SANGRE FORMADO DURANTE LA VIDA.

5. EMBOLO - MASA SÓLIDA, LÍQUIDA O GASEOSA INTRAVASCULAR INDEPENDIENTE LLEVADA EN SANGRE AL LUGAR DISTANTE DEL PUNTO DE ORIGEN - Ej. GRASA, BURBUJA DE AIRE O N₂, PLACA ATEROESCLERÓTICA, TUMOR, MÉDULA ÓSEA, CUERPOS EXTRAÑOS, TROMBO.

- Causar daño celular por (daño por radicales libres):
- Peroxidación lipídica de membranas - Daño extenso de la membrana.
- Modificar el plegamiento incorrecto y la degradación del amplificador de las proteínas
- Daño al ADN - causa roturas de cadena simple y doble hebra - & gt resulta en envejecimiento celular - & gt transformación maligna

D - Degradación del ADN por endonucleasas - Fragmentos de cromatina nucleosomal -
Apariencia de la escalera de ADN
Activación de transglutaminasas (proteínas citoplasmáticas apoptóticas entrecruzadas)
Sin reacción inflamatoria cuerpos apoptóticos

RESPUESTA INFLAMATORIA MARCADA:
- ENZIMAS LISOSOMALES - MEMBRANAS CELULARES DIGESTIVAS, CÉLULAS ALTERADAS
- MACRÓFAGOS DESPUÉS DE LA LIBERACIÓN DE FACTORES QUIMOTÁCTICOS
- ELIMINACIÓN DE ESCOMBROS MEDIANTE MACRÓFAGOS FAGOCÍTICOS

Características generales y celulares:
1. HETERÓLISIS - Degradación celular por enzimas EXTRÍNSECAS a la célula (ej. Bacterias, leucocitos) - aumento del citoplasma rosado
2. Cambios nucleares: microscopía óptica
Condensación nuclear progresiva con eventual desaparición de núcleos teñidos. conocer estos cambios nucleares ver foto.
2a. PICNOSIS - `` ENCOGIMIENTO '' DEL NÚCLEO EN GRUPOS DE CROMATINA PEQUEÑOS Y PROFUNDAMENTE BASÓFILOS / NEGROS
2b. KARYORRHEXIS - & quotFRAGMENTACIÓN & quot NÚCLEO EN MÚLTIPLES PUNTOS NEGROS PEQUEÑOS / PIEZAS
2c. CARIÓLISIS - "DESCENSO" DEL NÚCLEO MENOS Y MENOS BASOFÍLICO HASTA DESAPARECE.

TIPOS:
1) NECROSIS COAGULATIVA [[p. Ej. quemadura química por infarto agudo de miocardio (aspirina)]
= TIPO MÁS COMÚN = PÉRDIDA SÚBITA DE AYUDA DE SANGRE A ÓRGANOS (ISQUEMIA): CORAZÓN Y RIÑÓN (ARTERIAS CON CIRCULACIÓN COLATERAL LIMITADA), GLÁNDULAS SUPRARRENALES, NO VISUALES EN EL CEREBRO = DENATURACIÓN DE PROTEÍNAS = ETAPAS TEMPRANAS W. CONSERVACIÓN DE TEJIDOS. w. ARQUITECTURA GENERAL BIEN CONSERVADA, Condensación nuclear progresiva con eventual desaparición de núcleos teñidos
Aumento de estructuras de citoplasma rosado ('eosinofílico' 'vidrioso') 'similar a un fantasma'.
2) NECROSIS LICUOFACTIVA = DIGESTIÓN DEL TEJIDO BRUTO = HISTOLOGÍA LÍQUIDA: SUAVIZANTE Y LICUADO DEL TEJIDO LESIÓN GENERALMENTE ISQUÉMICA DEL SNC EN GENERAL INFECCIÓN BACTERIANA TAMBIÉN INFECCIONES SUPURATIVAS (FORMACIÓN DE PUS) (INFLAMACIÓN AGUDA) W.
RESIDUOS DE TEJIDOS LICUADOS Y RESPUESTA INFLAMATORIA INTENSA DE NEUTROFILOS = ABSCESO (colección focal de neutrófilos).

3) NECROSIS CASEOSA = MÁS A MENUDO VISTO EN TUBERCULOSIS
= CONSISTENCIA DE QUESO = HISTOLOGÍA: ARQUITECTURA NO PRESERVADA ROSA AMORFA, POCOS NÚCLEOS GRANULARES (SIN APARIENCIA DE FANTASMA) = COMBINA CARACTERÍSTICAS DE NECROSIS COAGULATIVA Y LICUOFACTIVA = OCURRE COMO PARTE DE GRANULAMOMACIÓN DE GRANOMATIZACIÓN LINFOCITOS Y CÉLULAS GIGANTES MULTINUCLEADAS. p.ej. en el pulmón - pic.

4) NECROSIS GANGRENOSA = EXTENSIVA = INTERRUPCIÓN DEL SUMINISTRO SANGUÍNEO HASTA LAS EXTREMIDADES INFERIORES O EL INTESTINO (SECUNDARIO A LA OCLUSIÓN VASCULAR) = LA MAYORÍA DE LAS INFECCIONES BACTERIANAS = YA SEA: (A) & quot; GANGRENE & quot; HÚMEDO & quot; GANGRENE W. W. NECROSIS COAGULATIVA SIN LICUOFACCION. (¡CONOZCA LA DIFERENCIA ENTRE HÚMEDO Y SECO!) - p. Ej. foto de NOMA.

5) NECROSIS FIBRINOIDE = VISTA SOLO POR EXAMEN MICROSCÓPICO = A MENUDO ASOCIADO CON VASCULITIS MEDIADA POR INMUNIDAD = TEJIDO CONECTIVO Y MÚSCULO REEMPLAZADO POR FIBRINA HOMOGÉNEA MATERIAL ROSADO QUE SE PARECE = EX. DEPOSICIÓN DE MATERIALES FIBRINOS EN LAS PAREDES ARTERIALES


Ver el vídeo: Lac Operon Mutations (Agosto 2022).