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¿Cómo solucionar problemas de fijación de formaldehído in vitro para nucleosomas?

¿Cómo solucionar problemas de fijación de formaldehído in vitro para nucleosomas?



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Para un experimento, estoy tratando de arreglar los mononucleosomas (100 ng) usando formaldehído como agente de reticulación en tampón HEPES. He estado usando formaldehído al 2% en un tampón de reacción que contiene EDTA 1 mM, NaCl 25 mM y HEPES 50 mM, pH 7,5 (igual que el tampón de suspensión de nucleosomas) para fijar mononucleosomas.

En mi primera reacción, agregué 100 ng de nucleosomas, formaldehído al 2% y lo incubé a 4 ° C, 30 ', luego agregué SDS al 0,4% y lo incubé durante 30' a temperatura ambiente. Observé una banda menos intensa pero igualmente nítida para los nucleosomas (menos frotis) en comparación con los nucleosomas no fijos.

Cuando realicé la misma reacción nuevamente, el gel mostró una gran mancha que cubría todo el carril en lugar de una banda afilada.

He estado leyendo sobre las reacciones de fijación y encontré un énfasis en el uso de formaldehído libre de metanol (mientras usaba metanol al 10-15% que contenía formaldehído). ¿Crees que puede ser un factor para no poder obtener resultados similares?


Hemos utilizado la reticulación de proteínaADN mediada por formaldehído dentro de células intactas para examinar la estructura de cromatina in vivo de la proteína de choque térmico de D. melanogaster 70 (hsp70) genes. De acuerdo con estudios in vitro previos, encontramos que la inducción transcripcional mediada por choque térmico del hsp70 Los genes perturban su estructura de cromatina, lo que resulta en menos contactos de proteínaADN reticulables in vivo por formaldehído. Sin embargo, contrariamente a la evidencia in vitro anterior de que las histonas pueden estar ausentes en genes transcritos activamente, mostramos directamente, por inmunoprecipitación de fragmentos de cromatina reticulados in vivo, que al menos la histona H4 permanece unida a hsp70 ADN in vivo, independientemente de su velocidad de transcripción. Las técnicas de mapeo in vivo basadas en formaldehído descritas en este trabajo son generalmente aplicables y pueden usarse tanto para sondear interacciones proteínaADN dentro de genes específicos como para determinar la ubicación genómica de proteínas cromosómicas específicas.

Dirección actual: Departamento de Bioquímica y Biofísica, Universidad de California, San Francisco, California 94143.


Abstracto

Fondo

Los adhesivos tisulares a base de cianoacrilato (CA), aunque no se utilizan ampliamente, son una opción factible para fijar una malla durante la reparación de una hernia abdominal, debido a su rápida acción y gran fuerza de unión. Su principal desventaja, la toxicidad, puede mitigarse aumentando la longitud de su cadena de alquilo. El objetivo era evaluar la in vitro citotoxicidad y en vivo biocompatibilidad en la reparación de hernias de AC que se utilizan actualmente en la práctica clínica (Glubran (n-butyl) e Ifabond (n-hexyl)) y un AC de cadena más larga (OCA (n-octyl)), que nunca se ha utilizado en el campo médico .

Métodos

La liberación de formaldehído y la citotoxicidad de los AC no polimerizados (UCA) y polimerizados (PCA) se evaluaron mediante evaluación visual macroscópica, citometría de flujo y ensayos de azul Alamar. En la evaluación preclínica, se crearon defectos parciales en la pared abdominal del conejo y se repararon mediante la fijación de prótesis de polipropileno utilizando los AC. A los 14 días después de la cirugía, los animales fueron sacrificados para análisis de morfología, respuesta de macrófagos y daño celular.

Resultados

La liberación de formaldehído fue menor a medida que aumentaba el peso molecular del monómero. El CA de cadena lateral más larga (OCA) mostró la mayor citotoxicidad en la condición de UCA. Sin embargo, tras la polimerización, fue el que mostró mejor comportamiento en la mayoría de las ocasiones. En vivo, todas las AC promovieron una fijación óptima de la malla sin desplazamientos ni desprendimientos. El seroma fue evidente con el uso de Glubran (cuatro de seis animales: 4/6) e Ifabond (2/6), pero se redujo con el uso de OCA (1/6). Se observaron respuestas de macrófagos significativamente mayores en los grupos en los que se utilizaron Glubran e Ifabond frente a suturas y OCA. Las células TUNEL-positivas fueron significativamente más altas en los grupos Glubran y OCA en comparación con el grupo de sutura.

Conclusiones

Aunque se produjo una liberación leve de formaldehído, el OCA fue el más citotóxico durante la polimerización pero el menos una vez curado. Los AC promovieron la fijación adecuada de la malla y tienen potencial para reemplazar las técnicas de sutura tradicionales en la reparación de hernias. Los AC mostraron una buena integración tisular y una biocompatibilidad eficaz a corto plazo, con la más mínima respuesta de seroma y macrófago inducida por OCA.

Citación: Pascual G, Sotomayor S, Rodríguez M, Pérez-Köhler B, Kühnhardt A, Fernández-Gutiérrez M, et al. (2016) Citotoxicidad de adhesivos tisulares a base de cianoacrilato y preclínicos a corto plazo En vivo Biocompatibilidad en la reparación de hernias abdominales. PLoS ONE 11 (6): e0157920. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0157920

Editor: Alberto G. Passi, Universidad de Insubria, ITALIA

Recibió: 29 de enero de 2016 Aceptado: 7 de junio de 2016 Publicado: 20 de junio de 2016

Derechos de autor: © 2016 Pascual et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia de Atribución Creative Commons, que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se acredite el autor y la fuente originales.

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro de los archivos del documento.

Fondos: El estudio contó con el apoyo de la Beca SAF2014-55022-P del Ministerio de Economía y Competitividad, España.

Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia.


RESULTADOS

Las histonas de las arqueas están presentes en los nucleosomas de las arqueas enVivo.

Anterior in vitro Los estudios se han centrado principalmente en las histonas HMf del hipertermófilo, M. fervidus, aunque las histonas de arqueas con secuencias & gt80% idénticas a las histonas HMf están presentes en otros Arqueas (2, 4). Esto incluye las histonas HMt en M. thermoautotrophicum (23), que se incluyó en esta investigación porque se dispone de una endopeptidasa que genera protoplastos a partir de M. thermoautotrophicum células (15) que podrían lisarse suavemente mediante la adición de detergente, eliminando así la necesidad de un paso de rotura celular físicamente disruptivo. La cepa de Marburg de M. thermoautotrophicum se eligió para el estudio porque este metanógeno contiene un plásmido, pME2001 (24), que agregó la oportunidad de aislar y caracterizar complejos discretos de proteína-ADN. M. thermoautotrophicum Los protoplastos de la cepa Marburg se expusieron a formaldehído y se lisaron mediante adición de SDS, y los complejos presentes se separaron por sedimentación mediante gradientes de sacarosa. Los complejos en cada fracción de los gradientes de sacarosa se separaron adicionalmente mediante electroforesis en gel de agarosa, se tiñeron y luego se sondaron mediante inmunotransferencia usando antisuero anti-HMt. Se separaron por electroforesis dos complejos que contenían pME2001, con movilidades consistentes con la presencia de ADN plásmido superenrollado y relajado, y ambos contenían HMt (Figs.1 a y B). Visualización EM de estos complejos que contienen plásmidos (Fig.1C) y del ADN genómico propagado directamente a partir de protoplastos rotos (Fig.1mi), demostró la presencia de estructuras que se asemejaban visiblemente a los nucleosomas, y el HMt localizado con marcaje inmunológico de oro en estas estructuras (Fig.1D). El ADN genómico también contenía muchos bucles de ADN pequeños, en consonancia con los restos de nucleosomas de arqueas que habían perdido sus componentes proteicos después de su adsorción al soporte de mica utilizado para la visualización EM (18).

Aislamiento y EM de nucleosomas de arqueas de M. thermoautotrophicum cepa Marburg. (a) Separación electroforética de complejos que contienen pME2001 en fracciones de gradiente de sacarosa de un lisado de protoplastos fijados con formaldehído. (b) Inmunoblot de los complejos en a, generado con antisuero anti-HMt. (C) EM de un complejo pME2001 – HMt (Bar = 200 nm). (D) pME2001 – HMt – anti-HMt – IgG complejo inmuno-marcado (puntos negros) con un conjugado de proteína A – perlas de oro. (mi) EM de ADN genómico de un protoplasto fijado con formaldehído.

La digestión MN genera escaleras de ≈60 pb a partir de cromatina Archaeal.

Digestión por nucleasa de cromatina eucarial, formaldehído reticulado en vivo, genera una escalera de moléculas de ADN con longitudes de ≈146 pb y múltiplos de 146 pb, que resultan de la protección de nucleasas por uno o más nucleosomas adyacentes (17, 18, 25). Exposición de complejos de nucleoproteínas aislados de tratados con formaldehído M. thermoautotrophicum o M. fervidus a MN generaron fragmentos protegidos con nucleasa que tenían ~ 60 pb y múltiplos de ~ 60 pb, de longitud, y con una exposición creciente a MN solo quedaban fragmentos de ~ 60 pb (Fig.2a).

Contenido de ADN y proteínas de nucleosomas de arqueas. (a) Separación electroforética de fragmentos de ADN protegidos de la digestión de MN en complejos de nucleoproteínas aislados de fijados con formaldehído M. fervidus. La digestión de MN se realizó durante 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 30 y 45 min a 37ºC. Las pistas de control contenían estándares de tamaño y complejos no digeridos (O). (B) Separación electroforética y tinción con plata de las proteínas aisladas de los complejos indicados en a que protegían fragmentos de ADN de ~ 60 pb de la digestión con MN. La purificación de estas proteínas implicó incubaciones con β-agarasa y DNasa I, y las pistas de control demuestran los polipéptidos presentes en estos reactivos. Quedaron pequeñas cantidades de estos polipéptidos en el material experimental. Junto al gel teñido se muestra una inmunotransferencia de las proteínas purificadas generadas con anticuerpos anti-HMf.

Las histonas de arqueas están reticuladas enVivo en tetrameros.

Los complejos que demostraron proteger fragmentos de ADN de ≈60-bp de la digestión con MN se purificaron, después de la exposición a MN, mediante cromatografía de filtración en gel y electroforesis en gel de agarosa. Después de la digestión con DNasa I, las proteínas que quedaron se separaron mediante tricina-SDS / PAGE, se tiñeron con plata y se sometieron a inmunotransferencia. Como se muestra en la Fig.2B, los únicos polipéptidos presentes distintos de la ADNasa I detectables mediante tinción con plata se identificaron mediante inmunotransferencia como monómeros, dímeros y tetrámeros de histonas. No hubo trímeros reticulados, ni hubo evidencia de reticulación de las histonas de arqueas en oligómeros más grandes que los tetrámeros.

Relación entre histonas arqueales y ADN enVivo y localización del genoma.

Las histonas eucariales son proteínas abundantes que empaquetan casi todo el ADN nuclear en cromatina, aunque algunos nucleosomas están posicionados, y el ensamblaje y desensamblaje localizado de los nucleosomas juega un papel importante en la regulación de la expresión génica eucarística (25). Para determinar si estas características también pueden existir en Arqueas Se estableció la relación de histona a ADN, y la presencia o ausencia de regiones específicas de la M. fervidus genoma dentro de los complejos de histona-ADN en vivo estaba determinado. La cuantificación de las inmunotransferencias marcadas con 125 I reveló que HMf constituye ~ 4% de la proteína soluble total en M. fervidus (Fig. 3). Con base en la relación proteína-ADN total y un tamaño del genoma de 1,7 ± 0,2 Mbp, el rango de tamaño de los genomas de metanógenos estrechamente relacionados (26), esto equivale a un tetrámero de histona por ~ 67 pb de ADN genómico. Por tanto, parece que casi todos los M. fervidus Los tetrámeros de HMf podrían empaquetar el genoma en estructuras que contienen aproximadamente 60 pb de ADN.

Cuantificación de HMf. La inmunotransferencia de una curva estándar marcada con 125 I, adyacente a una alícuota de un M. fervidus lisado, se muestra arriba una cuantificación gráfica de este resultado.

Para determinar si regiones específicas del M. fervidus el genoma se asoció con HMf en vivo, Los complejos reticulados se separaron de las proteínas y del ADN libre de proteínas mediante centrifugación de densidad de flotación con CsCl, se sometieron a digestión con enzimas de restricción y se inmunoprecipitaron con IgG anti-HMf (Fig.4A y ref. 20). Después de la desproteinización, los fragmentos de ADN que quedaron se sondaron mediante transferencia Southern para determinar la presencia de regiones intergénicas aguas arriba y regiones codificantes de los genes de ARN estable 7S y 16S, la histona que codifica hmfA y hmfB genes y varios genes que codifican enzimas implicadas en la metanogénesis (2, 12, 18, 27). La hibridación se observó en todos los casos, a un fragmento de restricción del tamaño correcto, excepto cuando sondas específicas para el mcr se utilizaron operón (Fig.4B). Se observaron diferencias consistentes en las intensidades de la señal. Las secuencias 7S y 16S siempre estuvieron presentes a niveles relativamente altos en los complejos inmunoprecipitados, hmfA Las secuencias eran más abundantes que hmfB secuencias y, a pesar del uso de diferentes sondas y enzimas de restricción, señales para la mcr operón eran indetectables. Este no fue un caso general para todos los genes del metano. los ftr y mcr Los genes codifican las enzimas que catalizan los pasos segundo y séptimo en la metanogénesis del CO.2 y H2, respectivamente (12, 27) y ftr Las secuencias estaban presentes en complejos inmunoprecipitados (Fig.4B).

(A) Esquema del procedimiento utilizado para aislar e inmunoprecipitar complejos histona-ADN entrecruzados en vivo (20). (B) Southern blots generados con sondas específicas para el M. fervidus genes enumerados (27, 28). Las sondas (líneas cortas y pesadas) se diseñaron para hibridar, como se indica, con fragmentos de restricción de tamaño similar, ApoI A), HincII (H), RsaYo (r), y SspI (S), que abarca los sitios de transcripción (flecha doblada) e inicio de la traducción (barra gruesa). Como se ilustra, el ftr y mcr Los genes codifican las enzimas que catalizan los pasos segundo y séptimo en el CO2 reducción a CH4 (27-29). En el momento de la fijación del formaldehído, las células sintetizaban metano de forma activa, y los análisis de transferencia Northern demostraron que la ftr, mcr, hmfA, hmfB, Las transcripciones 7S y 16S fueron abundantes. Alícuotas (10% y 2%) del ADN total presente antes de la inmunoprecipitación (ver A) se sometieron a electroforesis en las pistas adyacentes a las pistas que contenían el ADN aislado de los complejos inmunoprecipitados (IP) por IgG anti-HMf (+ ab) o por el antisuero de control (-ab).


DISCUSIÓN

Anteriormente se demostró que los nucleosomas CENP-A eran más persistentes en la cromatina que la mayoría de los nucleosomas H3 (Bodor et al., 2013). Sin embargo, se desconoce qué causa exactamente la estabilización de estos nucleosomas a nivel molecular. Presumimos que los interactuadores directos del nucleosoma CENP-A, CENP-C y CENP-N, podrían estabilizar el nucleosoma CENP-A dando como resultado una retención más estable. Para probar esta hipótesis, examinamos las funciones de CENP-C y CENP-N en la estabilización de mononucleosomas CENP-A in vitro y cromatina CENP-A en centrómeros.

Observamos que CENP-N (aditivamente con CENP-C) estabiliza los penúltimos 10 pares de bases de ADN en un solo nucleosoma CENP-A, protegiéndolo así del desmontaje causado por dilución, aumento de la fuerza iónica o adsorción en varias rejillas EM. Un informe reciente señaló que CENP-N podría estabilizar el nucleosoma CENP-A mediante la fijación de CENP-A y ADN (Guo et al., 2017). Esto fue demostrado muy recientemente por estudios de crio-EM de un nucleosoma CENP-A en complejo con CENP-N (Chittori et al., 2017 Pentakota et al., 2017). Si bien no se observó interacción directa con los extremos del ADN en estas estructuras, CENP-N tiene una gran interfaz de interacción de ADN (15 pares de bases) cerca del bucle CENP-A L1, con el que también interactúa ampliamente. Posiblemente, la respiración de los extremos del ADN se impide por los contactos entre CENP-N y el ADN nucleosómico más adentro de la partícula. Nuestros datos in vitro son consistentes con las estructuras en las que los mononucleosomas de CENP-A forman partículas mucho más estables en presencia de CENP-C y / o CENP-N.

Por el contrario, en las células, no observamos un cambio significativo en los niveles de CENP-A centromérico en ausencia de CENP-C, CENP-N o ambos. Nuestros resultados son inconsistentes con un informe publicado recientemente (Guo et al., 2017) que muestra una pérdida de CENP-A en la cromatina cuando se elimina CENP-N. En un intento por resolver esta diferencia, obtuvimos la línea celular CENP-N-AID-GFP con CENP-A etiquetado con SNAP de Guo et al. (2017). Comparamos directamente su línea celular con las que usamos en este estudio y replicamos su protocolo experimental. A pesar de esto, no encontramos diferencias significativas entre las células tratadas con IAA y las de control en ninguna de las líneas celulares (Figura complementaria S6E). En particular, cuando los datos se analizaron como en Guo et al. (2017), la línea celular obtenida utilizada en ese estudio exhibió la mayor diferencia, una disminución del 23% ± 20% en el tratamiento con tratamiento con IAA, cuando tanto la señal de TMR-Star centromérica (Figura suplementaria S6E, arriba) como los cambios en el número de células (Figura complementaria S6E, en el medio) se incluyeron. Sin embargo, esta diferencia observada (pag valor = 0,3485) podría deberse en gran parte a cambios inespecíficos dependientes de IAA en el número de células (Figura complementaria S6E, centro), ya que una línea celular que no expresa proteínas etiquetadas con AID mostró una disminución del 16 ± 19% cuando se trató con IAA, cuando los cambios en se consideró el número de celda. Sin la normalización del número de celdas, este valor sería del 3 ± 8%. Aunque existen diferencias modestas en los niveles de expresión de SNAP-CENP-A y TIR1 entre las líneas celulares (Figura complementaria S6B), estas diferencias no pueden explicar la falta de desestabilización de los nucleosomas de CENP-A en nuestras manos. Por lo tanto, mientras observamos una estabilización del nucleosoma CENP-A por CENP-C y CENP-N in vitro, la eliminación de CENP-C y CENP-N in vivo no da como resultado una desestabilización significativa de CENP-A en la cromatina. Nos sorprendió que no observáramos ninguna pérdida de retención de nucleosomas CENP-A sin CENP-C y / o CENP-N en las células dado el efecto estabilizador de estas proteínas in vitro. Proponemos tres posibles explicaciones de por qué la pérdida de CENP-C y CENP-N tiene un efecto relativamente pequeño sobre la estabilidad del nucleosoma CENP-A in vivo, a pesar del efecto estabilizador demostrado sobre el nucleosoma CENP-A por CENP-C y CENP-N en vitro. Una posibilidad es que los nucleosomas de CENP-A interactúen con otros factores en el centrómero que promueven su estabilidad. Por ejemplo, CENP-B interactúa con la cola N-terminal de CENP-A y también se une al ADN y, por lo tanto, puede compensar la pérdida de CENP-C o CENP-N. Actualmente, solo CENP-N, CENP-C y CENP-B se han identificado como proteínas de unión al nucleosoma CENP-A específicas del centrómero. Recientemente se demostró que M18BP1 / KNL2 también puede unirse directamente a nucleosomas CENP-A en ranas (francés et al., 2017), pájaros (Hori et al., 2017) y plantas (Sandmann et al., 2017), lo que sugiere que también pueden existir otros factores en las células humanas que se unen y estabilizan los nucleosomas de CENP-A.

Una segunda interpretación de nuestros hallazgos es que a pesar del requisito de CENP-N y CENP-C en el ensamblaje del centrómero, la interacción con CENP-A puede ser menos crítica una vez que el CCAN se haya ensamblado correctamente.Encontramos que la sobreexpresión de CENP-N con etiqueta de rubí de longitud completa desplazó a CENP-N con etiqueta de GFP expresada a niveles endógenos, mientras que la sobreexpresión de versiones truncadas de CENP-N que carecían del dominio de interacción de CENP-L no desplazó a CENP-N con etiqueta de GFP CENP-N, a pesar de poder localizar en centrómeros (Figura suplementaria S4, D y E). El hecho de que su localización no desplaza al CENP-N endógeno sugiere dos modelos posibles: 1) que el número de sitios de unión de CENP-A excede el número de moléculas de CENP-N de longitud completa en el centrómero o 2) que una vez CENP-N se localiza en el centrómero al interactuar con CENP-A, ya no requiere que la interacción CENP-A permanezca en el centrómero y, en cambio, depende de sus interacciones con otros miembros de la CCAN. Este segundo modelo está respaldado por nuestros ensayos de lavado de sal basados ​​en células en los que los niveles de CENP-A disminuyeron con el aumento de sal, pero sin afectar la localización de CENP-C y CENP-N en el centrómero (Figura complementaria S5, D – F). Un estudio reciente demostró que la eliminación completa de CENP-A del centrómero no resultó en una disminución significativa de CENP-N que ya estaba unido al centrómero (Hoffmann et al., 2016). Una porción de CENP-C centromérico también es resistente a la degradación o dilución replicativa de CENP-A (Fachinetti et al., 2013 Hoffmann et al., 2016). Si el segundo modelo fuera correcto, entonces no podemos asumir que CENP-C o CENP-N se unen constitutivamente a CENP-A directamente, y en ausencia de tal interacción no esperaríamos diferencia en la estabilidad de CENP-A sin CENP-C o CENP. -NORTE.

En tercer lugar, el entorno que rodea a los nucleosomas de CENP-A difiere sustancialmente in vitro y en las células. In vitro, observamos cambios en la estabilidad de los nucleosomas de CENP-A en respuesta a la unión de CENP-N a concentraciones de sal intermedias. Si bien estas mediciones representan diferencias reales en la estabilidad del nucleosoma CENP-A, este cambio de estabilidad puede no traducirse en el entorno celular donde hay un hacinamiento sustancial y niveles regulados de cationes monovalentes y divalentes. In vitro, se observó una diferencia sustancial de estabilidad con y sin CENP-N solo por encima de NaCl 150 mM. De manera similar, en el ensayo de dilución, la presencia de CENP-N no dio como resultado una estabilización adicional a una concentración de nucleosoma de 300 nM, mientras que hubo un efecto triple reproducible a 150 nM. Si bien es difícil evaluar la concentración local de CENP-A en la célula, observamos que CENP-A aparece como un punto limitado por difracción en microscopía. Usando el número estimado de 200 nucleosomas CENP-A por centrómero (Bodor et al., 2014), y asumiendo que el centrómero ocupa una esfera con un radio limitado de difracción de 300 nm, entonces la concentración de nucleosomas de CENP-A sería ∼3 µM, y por lo tanto más allá de la “concentración crítica”. La concentración real de todos los nucleosomas si incluimos los nucleosomas H3 sería aún mayor.

Dado que no observamos un cambio en la retención de nucleosomas de CENP-A en las células, la naturaleza de esta retención sigue siendo difícil de alcanzar. En lugar de depender de las interacciones CCAN, los nucleosomas CENP-A podrían bloquearse en su lugar mediante la interacción con otros nucleosomas cercanos que se acercan mediante la organización tridimensional de la fibra de cromatina. Varios otros factores, como las modificaciones postraduccionales, las interacciones de ARN o las proteínas que interactúan con CENP-A aún por descubrir, también podrían contribuir a la estabilidad del nucleosoma de CENP-A. Puede ser que todos los nucleosomas alcancen el nivel básico de estabilidad para demostrar esta retención en las células, pero los nucleosomas de CENP-A pueden protegerse de los procesos desestabilizadores que desplazan a los nucleosomas de la cromatina. Varios estudios demuestran que una fracción de nucleosomas H3 persiste en la cromatina en las células en ciclo (Kimura y Cook, 2001 Radman-Livaja et al., 2011).

Además, aunque nos centramos en las células que se dividen rápidamente, Smoak et al. (2016) demostraron recientemente que existe una retención a largo plazo de CENP-A en los centrómeros en los ovocitos de ratón durante más de un año sin ensamblaje detectable. Sin embargo, esto puede no ser único, ya que la H3 es una de las proteínas de mayor duración en los tejidos posmitóticos (Commerford et al., 1982 Waterborg, 1993 Toyama et al., 2013). Desafortunadamente, los experimentos en células cultivadas solo pueden acceder a escalas de tiempo mucho más cortas y, por lo tanto, la estabilización de CENP-A por CENP-C y CENP-N que vemos in vitro puede ser relevante cuando se observa durante la vida útil de un ovocito o huevo.


Transcripción de in vitro cromatina ensamblada por Escherichia coli ARN polimerasa ☆

In vitro La cromatina ensamblada se preparó a partir de la forma I de ADN del virus de simio 40 y las cuatro histonas de timo de ternera H2a, H2b, H3 y H4. Transcripción de esta plantilla por Escherichia coli La holoenzima de la ARN polimerasa se inhibió al nivel de iniciación y no se observó ninguna terminación preferencial durante el alargamiento. La inhibición tanto del inicio como del alargamiento dependió del número de nucleosomas en los complejos reconstituidos. Se descubrió que la ARN polimerasa podía alargar las cadenas de ARN a través de las regiones del ADN ocupadas por nucleosomas. El alargamiento se facilitó en gran medida con una fuerza iónica aumentada. A estas concentraciones de sal, no se observó intercambio ni deslizamiento de las partículas del núcleo de histonas.


Un protocolo para la detección in vivo de especies reactivas de oxígeno

La 2 ', 7'-diclorofluoresceína (H2DCF) y el dihidroetidio (DHE) se han utilizado ampliamente en experimentos de cultivo de tejidos para evaluar la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Sin embargo, será más ventajoso poder detectar la producción de ROS en tiempo real en tejidos vivos, especialmente en Drosophila donde las extensas herramientas genéticas disponibles permiten comparar el fenotipo de tejido mutante yuxtapuesto a su vecino de tipo salvaje. Aquí, describimos un protocolo para la producción de imágenes de ROS en Drosophila utilizando H2DCF o DHE. Destacamos la ventaja específica planteada por el seguimiento de la producción de ROS in vivo mediante la comparación del fenotipo de células mutantes para genes que codifican proteínas mitocondriales con sus vecinos de tipo salvaje. También demostramos a partir de la tinción del germario que esta técnica es capaz de detectar diferentes niveles de producción de ROS entre células dentro del mismo tejido. Todo el protocolo, desde la disección hasta la captura de imágenes mediante microscopía confocal, se puede completar en 2 a 3 horas y se puede adaptar para su uso en prácticamente cualquier tejido de Drosophila.

Introducción

Todos los organismos aeróbicos dependen del oxígeno molecular para sobrevivir. Durante el metabolismo energético aeróbico, los electrones se transportan a través de una serie de portadores de electrones en la mitocondria para generar una fuerza electromotriz que se aprovecha para sintetizar ATP; el aceptor final de electrones, el oxígeno molecular, se reduce para formar agua (1). Sin embargo, lo que podría parecer un método rentable para sintetizar ATP está plagado de problemas, ya que una buena proporción del oxígeno molecular escapa a la reducción completa y se reduce parcialmente para formar una gran cantidad de metabolitos de oxígeno altamente reactivos, denominados colectivamente oxígeno reactivo. especies (ROS). Si bien existen numerosas fuentes endógenas y exógenas de ROS, más del 90% de las ROS se produce en las mitocondrias (2).

La obtención de imágenes directas de ROS en muestras biológicas ha demostrado ser un gran desafío. Las ROS son por naturaleza moléculas muy reactivas y, por lo tanto, son extremadamente inestables, lo que hace que sea imposible visualizarlas directamente. Por lo tanto, la detección de los niveles de ROS se ha basado en gran medida en la detección de productos finales, ya sea por quimioluminiscencia o por fluorescencia, que se forman cuando compuestos específicos reaccionan con ROS (3 4).

Una de las técnicas para detectar ROS intracelulares, en particular el peróxido de hidrógeno, depende de la oxidación del sustrato no fluorescente 2 ', 7'-diclorofluoresceína (H2DCF) a un producto verde fluorescente (5, 6). Como las membranas celulares son permeables a las formas esterificadas de H2DCF, pueden ingresar a las células libremente, donde, como resultado de la desacetilación por las esterasas intracelulares, quedan atrapadas intracelularmente. Dependiendo de la naturaleza de la muestra utilizada y de la pregunta que se haga, la velocidad de oxidación puede controlarse mediante un fluorímetro, microscopía de fluorescencia o citometría de flujo. Sin embargo, al igual que otros tintes para la detección de ROS, se han planteado varias preocupaciones en relación con esta técnica. Por ejemplo, se ha informado que incluso después de la hidrólisis por esterasas intracelulares, el producto oxidado es capaz de escaparse de algunos tipos de células (7). Además, el tinte puede ser oxidado por una gran cantidad de especies ROS como el óxido nítrico, los aniones peroxinitrito e incluso los hidroperóxidos orgánicos (8 9 10). En particular, incluso en los casos en que el H2DCF se oxida con peróxido de hidrógeno, la reacción se acelera significativamente por la presencia de peroxidasas 10. En otro informe, se demostró que la oxidación de H2DCF dependía de la concentración de glutatión (11). Por lo tanto, se ha sugerido que en lugar de servir como una prueba específica de una mayor producción de ROS, el H2DCF es quizás un indicador del grado de estrés oxidativo general.

El dihidroetidio (DHE), en virtud de su capacidad para penetrar libremente en las membranas celulares, se usa ampliamente para controlar la producción de superóxido (12 13 14). Durante mucho tiempo se había postulado que el DHE al reaccionar con aniones superóxido forma un producto rojo fluorescente (etidio) que se intercala con el ADN (15 16). Sin embargo, estudios más recientes han sugerido que el producto es en realidad 2-hidroxietidio (17). El DHE es quizás el colorante más específico y menos problemático, ya que detecta esencialmente radicales superóxido, es retenido bien por las células e incluso puede tolerar una fijación leve. (18 19)

En el presente documento describimos un protocolo detallado para el seguimiento de la producción de ROS in vivo y en varios tejidos diferentes, utilizando dos tintes fluorescentes (es decir, H2DCF y DHE).

Reactivos

  1. 1X PBS
  2. 1X Schneider's Drosophila Medium + L-Glutamine (GIBCO, cat. No. 11720
  3. Dimetilsulfóxido anhidro (DMSO) & gt 99,9% (Sigma-Aldrich, cat. No. 276855)
  4. Dihydroethidium - embalaje especial (Invitrogen Molecular Probes, cat no. D11347)
  5. 5- (y-6) -carboxi-2 ’, 7’-diclorodihidrofluoresceína diacetato, acetil éster (CM-H2DCFDA) - embalaje especial (Invitrogen Molecular Probes, cat no. C6827)
  6. Formaldehído, 37% p / p (Fisher Scientific, cat. No. F79 - 500)
  7. Medio de montaje VECTASHIELD (laboratorios Vector, cat. No. H-1000)
  8. Drosophila larvas o adultos (dependiendo del tejido a examinar)

Equipo

  1. Viales de comida para moscas
  2. Microscopio de disección
  3. Agitador orbital btb de 12 voltios (Bellco)
  4. Portaobjetos de vidrio de tres pocillos - Micro Spot Plate (Electron Microscopy Sciences, cat. No. 71561-01)
  5. Pinza de Dumont n. ° 5
  6. Tubos de microcentrífuga de 2 ml
  7. Pipetman (Gilson, P-20, P-200 y P1000)
  8. Puntas de pipeta (Rainin)
  9. Micro portaobjetos Gold Seal rite-on previamente limpiados (Gold Seal Products, cat. No. 3050)
  10. Vidrio de cubierta Corning, n. ° 1, 22 × 40 mm (Corning, n. ° de catálogo 2935-224)
  11. Esmalte de uñas
  12. Software de imágenes y microscopios confocales

Configuración de reactivo

  • Preparación de moscas / larvas adultas para la disección Instale los cruces de tal manera que se reduzca el hacinamiento tanto como sea posible. Además, dado que los datos obtenidos son una instantánea de la tasa de producción de ROS, es importante que las larvas o los adultos (según el tejido que se examinará) estén bien alimentados para garantizar que respiren de manera óptima.
  • Preparación de soluciones madre de H2DCF y DHE Ambos colorantes deben reconstituirse utilizando solo DMSO anhidro. El DMSO anhidro se puede dividir en alícuotas en porciones de 1 ml y mantener en un desecador. Las soluciones madre deben prepararse inmediatamente antes de su uso y utilizarse preferiblemente para un lote de experimentos. Prepare una solución madre 10 mM de H2DCF y una solución madre 30 mM de DHE

Procedimiento

  • 1. Las larvas en la etapa de desarrollo adecuada se recogen con un pincel y se colocan en PBS en placas de tres pocillos, a temperatura ambiente. Alternativamente, para tejido adulto como el germarium, las hembras de la edad adecuada se anestesian y se recogen en tubos eppendorf de 2 ml.
    • PASO CRÍTICO No use PBS helado, ya que esto puede inhibir la respiración y por lo tanto interferir con la producción de ROS.
    • PASO CRÍTICO No disecar en medio de Schneider, ya que la presencia de aminas primarias de los aminoácidos que contiene puede conducir a la hidrólisis extracelular del tinte. Además, es importante eliminar la mayor cantidad posible de tejido extraño. Por ejemplo, para los discos oculares del tercer estadio, el cerebro y las glándulas salivales deben extraerse en esta etapa (dejando solo los ganchos de la boca para facilitar la transferencia). Esto acelerará el proceso de montaje. Los retrasos en el montaje comprometerán la calidad de la imagen.

    A) Producción de imágenes de ROS utilizando H2DCF

    • 3. Reconstituya el colorante inmediatamente después de la disección e inmediatamente antes de usarlo en DMSO anhidro (consulte la preparación del reactivo).
      • SOLUCIÓN DE PROBLEMAS
      • PASO CRÍTICO Agitar en vórtex durante unos 15 a 30 segundos suele ser lo óptimo. El vórtice excesivo puede acelerar la descomposición del tinte, ya que está sujeto a hidrólisis, por otro lado, los tiempos de agitación más cortos pueden resultar en una dispersión incompleta del tinte, lo que resulta en la deposición de coloides en el tejido.
      • ? SOLUCIÓN DE PROBLEMAS
      • ? SOLUCIÓN DE PROBLEMAS
      • ? SOLUCIÓN DE PROBLEMAS

      B) Producción de imágenes de ROS utilizando DHE

      • 3. Recolecte y diseccione el tejido como en los pasos 1 y 2 anteriores. Sin embargo, en este caso, el tejido debe disecarse e incubarse en medio de Schneider para permitir una respiración óptima.
      • 4. Reconstituya el colorante inmediatamente después de la disección e inmediatamente antes de usarlo en DMSO anhidro (consulte la preparación del reactivo).
        • PASO CRÍTICO La solución de tinte reconstituida debe tener un color ligeramente rosado, un color más intenso como el púrpura puede ser indicativo de autooxidación del tinte.
        • PASO CRÍTICO Igual que en el paso A4.
        • ? SOLUCIÓN DE PROBLEMAS
        • PASO CRÍTICO Al examinar por primera vez un tejido para determinar la producción de ROS utilizando DHE, es importante seguir el protocolo sin fijar para obtener una indicación precisa de la producción de ROS vivos. Sin embargo, el paso de fijación suave que se describe aquí facilita el análisis de la producción de ROS en clones marcados con GFP, ya que las muestras de GFP completamente no fijadas tienden a producir clones con límites difusos. La duración de la fijación es crucial y puede que tenga que determinarse empíricamente para el tejido de interés y la variante particular de GFP utilizada: muy poca fijación producirá límites difusos de GFP pero retendrá significativamente la señal de ROS, la fijación excesiva producirá límites claros de GFP pero comprometerá la señal ROS.

        Momento

        El tiempo necesario para la recolección y disección de larvas / moscas adultas es variable, pero suele oscilar entre 30 minutos y 1 hora, según el número recolectado y la experiencia del investigador. Los pasos intermedios suelen durar alrededor de una hora, mientras que la captura mediante microscopía confocal tarda unos 30 minutos. Por tanto, todo el procedimiento se puede realizar en 2 a 3 horas.

        Solución de problemas

        Los consejos para la resolución de problemas se pueden encontrar en la Tabla 1.

        Resultados previstos

        Como se muestra en la figura 1, el protocolo para la detección de ROS mediante DHE se puede utilizar para evaluar la producción de ROS en prácticamente cualquier Drosophila tejido. Dado que los inhibidores del complejo I de mitocondrias, como la rotenona, conducen a un aumento de la producción de ROS, derribamos la expresión de la subunidad 75 de la proteína del complejo I NaDH Deshidrogenasa (es decir, ND75), utilizando la interferencia de ARN (ARNi). Los clones de Ay-GAL4 (20) que expresan RNAi a ND75 tanto en la glándula salival como en el cuerpo graso mostraron una mayor producción de ROS como se esperaba (figura 1a-f). Además, monitoreamos la producción de ROS en ey-flp (promotor sin ojos que impulsa la expresión de la flippasa) generaron clones que eran mutantes para la proteína del complejo I Pdsw y observamos una mayor producción de ROS (figura 1g - i). Esto establece además que el protocolo es adecuado para su uso en múltiples tejidos.

        En particular, el seguimiento de la producción de ROS en el germarium de tipo salvaje reveló que este protocolo es lo suficientemente sensible como para discriminar entre diferentes niveles de producción de ROS entre diferentes tipos de células del mismo tejido (figura 1j).

        Referencias

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        2. Boveris, A. & amp Chance, B. La generación mitocondrial de peróxido de hidrógeno. Efectos y propiedades generales del oxígeno hiperbárico. Biochem J 134, 707-16 (1973).
        3. Freeman, B.A. & amp Crapo, J.D. Biología de la enfermedad: radicales libres y lesión tisular. Lab Invest 47, 412-26 (1982).
        4. Pryor, W.A. & amp Godber, S.S. Medidas no invasivas del estado de estrés oxidativo en humanos. Radic libre Biol Med 10, 177-84 (1991).
        5. Mills, E.M. et al. El tratamiento con factor de crecimiento nervioso previene el aumento de superóxido producido por el factor de crecimiento epidérmico en las células PC12. J Biol Chem 273, 22165-8 (1998).
        6. Sundaresan, M., Yu, Z.X., Ferrans, V.J., Irani, K. & amp Finkel, T. Requisito para la generación de H2O2 para la transducción de señales del factor de crecimiento derivado de plaquetas. Ciencias 270, 296-9 (1995).
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        8. Gabriel, C. y col. Determinación de la generación de óxido nítrico en neuronas de mamíferos usando diacetato de diclorofluorescina y citometría de flujo. Métodos de J Pharmacol Toxicol 38, 93-8 (1997).
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        11. García-Ruiz, C., Colell, A., Mari, M., Morales, A. & amp Fernandez-Checa, J.C. El efecto directo de la ceramida en la cadena de transporte de electrones mitocondrial conduce a la generación de especies reactivas de oxígeno. Papel del glutatión mitocondrial. J Biol Chem 272, 11369-77 (1997).
        12. Bindokas, V.P., Jordan, J., Lee, C.C. y Miller, R.J. Producción de superóxido en neuronas del hipocampo de rata: imágenes selectivas con hidroetidina. J Neurosci 168, 1324-36 (1996).
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        Cifras

        Figura 1: Producción de ROS visualizada en múltiples tejidos

        • (a-f) Los clones de Ay-GAL4 (verde), en los que la expresión de ND75 es anulada por el ARNi, producen niveles aumentados de ROS (rojo). Esto es evidente en los clones generados en la glándula salival (a-c) o en el cuerpo graso (d-f).
        • (g-i) En los discos oculares del tercer estadio, los clones somáticos (falta de verde) del gen del complejo I, pdsw (pdsw - / -) muestran una mayor producción de ROS en comparación con los vecinos de tipo salvaje.
        • (j) Una célula en la región de las células madre somáticas (flecha) produce niveles más altos de ROS que cualquiera de las dos células vecinas. Curiosamente, las dos celdas vecinas (compare la celda con punta de flecha con la otra celda vecina) producen diferentes niveles de ROS. Además, las células en las cámaras de huevos más maduras producen niveles aún más altos de ROS, quizás un reflejo del hecho de que estas células almacenan mitocondrias..

        Tabla 1: Solución de problemas

        Publicaciones asociadas

        Distintas señales mitocondriales retrógradas controlan el punto de control del ciclo celular G1-S, Edward Owusu-Ansah, Amir Yavari, Sudip Mandal y Utpal Banerjee, Genética de la naturaleza 40 (3) 356 - 361 03/02/2008 doi: 10.1038 / ng.2007.50

        Información del autor

        Edward Owusu-Ansah y Amir Yavari, Departamento de Biología Molecular, Celular y del Desarrollo, Universidad de California, Los Ángeles, Los Ángeles, California 90095, EE. UU.

        Utpal Banerjee, Departamento de Biología Molecular, Celular y del Desarrollo, Instituto de Biología Molecular y Departamento de Química Biológica, Universidad de California, Los Ángeles, Los Ángeles, California 90095, EE. UU.

        Fuente: Protocol Exchange (2008) doi: 10.1038 / nprot.2008.23. Publicado originalmente en Internet el 27 de febrero de 2008.


        Perfilado de cromatina: de ChIP a CUT & ampRUN y CUT & ampTag

        MNase-seq modificada: Los métodos que se han utilizado para preparar cromatina para el perfilado por inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) típicamente han involucrado sonicación, limitando la resolución a unos pocos cientos de pares de bases. La nucleasa microcócica (MNasa) escinde el ADN bicatenario y luego "mordisquea" los extremos expuestos hasta que alcanza un impedimento, como un nucleosoma. Los fragmentos de ADN protegidos de la MNasa por el nucleosoma pueden recuperarse, secuenciarse y alinearse con una secuencia conocida para proporcionar un mapa preciso de las posiciones de los nucleosomas. Sustituyendo el paso típico de purificación en gel del tamaño de un mononucleosoma de MNase-seq con una limpieza de perlas Ampure y preparando bibliotecas de secuenciación de extremos emparejados, adaptamos un método para el mapeo de nucleosomas en uno que sea adecuado para todas las proteínas de unión al ADN 1 . Aplicamos este sencillo protocolo a la levadura en ciernes y Drosophila, y mapeamos tanto nucleosomas como partículas del tamaño de subnucleosomas en resolución de pares de bases en todo el genoma. Para caracterizar la unión al ADN, introdujimos el "gráfico V", un gráfico de puntos de la longitud de cada fragmento frente a su posición en el genoma. Este procedimiento proporciona un mapeo de resolución de pares de bases de las regiones protegidas y expuestas en y alrededor de los sitios de unión, y también la determinación del grado en que están flanqueadas por nucleosomas en fase y partículas del tamaño de subnucleosomas. La separación de nucleosomas de otras proteínas de cromatina basada en el tamaño del fragmento proporciona una estrategia general para la caracterización completa del epigenoma a partir de una sola muestra.

        Perfilado ORGÁNICO: A continuación, agregamos purificación por afinidad de cromatina a nuestro protocolo MNase-seq para un método de ChIP nativo general, que luego denominamos "ORGÁNICO" (por Oocupado Regiones GRAMOenomes de Affinity-purified nortenaturalmente Isolado Chromatina), y aplicó este método al centrómero de levadura en gemación 2,3. En relación con el conjunto de datos Cse4 (levadura CenH3) X-ChIP-seq del grupo Snyder publicado en 2009, observamos una mejora de 2 órdenes de magnitud en ambas resoluciones (

        300 bp a 1-2 bp) y rango dinámico (200x a 25,000x). Es importante destacar que pudimos delinear la organización tripartita conocida de la

        Centrómero de levadura de 120 pb en términos del perfil del epigenoma, con el nucleosoma centromérico completamente confinado dentro del

        CDEII de 80 pb (Centromere DNA Element II). En contraste, los datos de X-ChIP colocaron los máximos de Cse4 justo fuera del centrómero funcional, quizás un ejemplo del artefacto "hiperchippable" descrito recientemente para este y otros conjuntos de datos de levadura en gemación estándar de X-ChIP por Teytelman et al. (2013) 4.

        A continuación, dirigimos nuestra atención a la familia SWI / SNF de translocasas de ADN dependientes de ATP, componentes abundantes pero dinámicos del epigenoma y, a menudo, difíciles de mapear mediante ChIP. Usando el protocolo ORGÁNICO, el postdoctorado Gabe Zentner mapeó las distribuciones genómicas de los remodeladores de levadura Isw1, Isw2 y Chd1 5. Aunque estos remodeladores actúan en los cuerpos de los genes, descubrimos que también están muy enriquecidos en las regiones empobrecidas en nucleosomas (NDR), donde se unen a regiones extendidas de ADN adyacentes a factores de transcripción particulares. Sorprendentemente, los remodeladores catalíticamente inactivos mostraron patrones de unión similares. Encontramos que la ocupación del remodelador en los NDR y los cuerpos génicos se asocia con el recambio de nucleosomas y la tasa de elongación transcripcional, lo que sugiere que los remodeladores actúan sobre regiones de desenvolvimiento o agotamiento transitorio de nucleosomas dentro de los cuerpos génicos posteriores al alargamiento transcripcional. Más evidencia de la aplicabilidad de la elaboración de perfiles ORGÁNICOS a los miembros de la familia SWI / SNF provino de nuestra demostración de que Mot1, que moviliza la proteína de unión a TATA (TBP), se acerca a la TBP desde arriba de 6, proporcionando así en vivo confirmación del modelo estructural Mot1 / TBP 7. El trabajo en remodeladores y TBP continuará con el posdoctorado Gabriel Zentner, quien inició su propio laboratorio en la Universidad de Indiana como profesor asistente de biología.

        La última demostración del poder de nuestro enfoque ORGÁNICO provino de su uso para mapear con éxito los factores de transcripción con mucha más precisión que cualquier método anterior. Se ha asumido ampliamente que la unión de un factor de transcripción (TF) con el ADN requiere una fijación covalente para evitar el desprendimiento durante la purificación por afinidad. Sin embargo, el estudio clásico de 1985 de Solomon y Varshavsky que a menudo se cita como un precursor de ChIP mostró que la fijación prolongada con formaldehído no pudo fijar el represor lac al operador lac. in vitro incluso después de una larga incubación 8. De hecho, no está claro hasta qué punto la fijación de formaldehído fija de forma covalente los TF al ADN en oposición al nucleosoma más cercano: por ejemplo, se ha estimado que

        2/3 de los sitios TF mapeados por el proyecto ENCODE están vinculados indirectamente al TF, no directamente al motivo que el TF ha evolucionado para unirse 9. Razonamos que la unión de alta afinidad de un TF debería persistir en las condiciones de baja sal que usamos para la digestión de MNasa de núcleos intactos y que, en cualquier caso, la difusión al ADN expuesto durante o después del tratamiento con MNasa es poco probable debido a la rápida eliminación de los núcleos expuestos. ADN por la nucleasa. De hecho, cuando el estudiante de posgrado Siva Kasinathan aplicó el perfil ORGÁNICO a los TF de levadura en ciernes, descubrió que las interacciones directas TF-cromatina se mapearon en alta resolución y con alta especificidad y sensibilidad 10. De novo El descubrimiento de motivos reveló que la gran mayoría de las llamadas de sitios de unión ORGÁNICOS tienen el motivo de consenso esperado y corresponden a huellas de DNasa I, lo que sugiere una presencia directa en vivo vinculante. Nuestro estudio también demostró la flexibilidad del perfil ORGÁNICO en el mapeo de sitios de unión genómica de proteínas con dominios de unión al ADN estructuralmente distintos de diferentes especies y mostró que la especificidad de los mapas ORGÁNICOS se puede modular variando la concentración de sal. En una comparación directa entre ORGANIC y ChIP-exo 11, el único método anterior de resolución de pares de bases, encontramos que casi el doble de sitios Reb1 de levadura ORGÁNICA contenían el motivo Reb1 conocido, que comprendía el 99,3% del total, mientras que el motivo Reb1 era encontrado solo en

        60% del total de sitios ChIP-exo y 98% de los sitios primarios. La simplicidad y alta eficiencia del perfilado ORGÁNICO lo hace adecuado para el perfilado a gran escala de ocupación TF.

        X-ChIP de alta resolución:Aunque el perfil ORGÁNICO proporciona un rango dinámico excepcionalmente alto, es menos adecuado para proteínas que son difíciles de solubilizar, como RNAPII. En consecuencia, introdujimos una modificación simple de X-ChIP-seq que demostró ser superior a X-ChIP y ChIP-exo estándar en resolución, especificidad y eficiencia 12. Utilizando un enfoque negativo dominante, hemos aplicado este protocolo para delinear las diferentes funciones del remodelador de Chd1 de ratón en los promotores y dentro de los cuerpos génicos. Encontramos que RNAPII requiere Chd1 para el escape del promotor 13. Por tanto, la torsión positiva, H2A.Z y Chd1 contribuyen a superar las barreras de los nucleosomas. Nuestro reciente hallazgo de que el remodelador del nucleosoma RSC de levadura desenvuelve parcialmente el nucleosoma 14 +1 centra aún más nuestra atención en cómo la torsión inducida por la transcripción, H2A.Z y la remodelación del nucleosoma interactúan en el nucleosoma +1 para interrumpir los nucleosomas y modular la expresión génica. La simplicidad y la alta eficiencia de nuestros nuevos métodos ChIP-seq deberían permitir a los laboratorios pequeños obtener perfiles de alta resolución muy superiores a los disponibles en ENCODE y otros megaproyectos de epigenómica.

        ChEC-seq: Postdoc Gabe Zentner, ahora en la Universidad de Indiana, modificó la escisión endógena de cromatina (ChEC) para una lectura de secuenciación de ADN (ChEC-seq) 15. ChEC usa la fusión de una proteína de interés con la MNasa para apuntar a la escisión inducible por calcio en células intactas. La adquisición de datos de ChEC-seq en una escala de tiempo de segundos a minutos reveló dos clases de sitios para TF de levadura, una que muestra una escisión rápida cerca de un lado de los motivos de consenso y la segunda que muestra una escisión lenta en los sitios sin motivo. Sorprendentemente, los sitios rápidos y lentos mostraron perfiles de forma de ADN casi idénticos (ancho de surco menor, torsión helicoidal, torsión y balanceo de la hélice), lo que implica que ChEC-seq resuelto en el tiempo detecta tanto interacciones de alta afinidad de TF con motivos de consenso como de baja afinidad. sitios de afinidad muestreados preferentemente por TF durante el escaneo en busca de características de forma de ADN. En nuestro estudio inicial, nos habíamos basado en la alineación de motivos de unión de sitios rápidos y lentos, y los sitios lentos se enriquecieron en sitios cercanos a sitios rápidos 16. Un nuevo análisis realizado por el estudiante de posgrado Siva Kasinathan 17 encontró que los sitios rápidos y lentos alineados únicamente por la forma en lugar del motivo y seleccionados para estar al menos a 100-500 pb del máximo de TF ChEC-seq más cercano también mostraron una fuerte correlación de forma entre rápido y sitios lentos, pero no con sitios aleatorios o sitios MNase gratuitos.

        Con los colaboradores Sebastian Grünberg y Steven Hahn 18, conectamos MNase a las subunidades Med8 y Med17 del módulo principal de Mediator, un coactivador de transcripción de 25 subunidades complejas cuyos sitios de unión genómica han sido difíciles de resolver con el chip convencional. En los datos resultantes de ChEC-seq, encontramos que Mediator se asocia con la mayoría de las secuencias de activación en sentido ascendente en el genoma de la levadura, en lugar de con los promotores centrales o los cuerpos génicos, y la ocupación se correlaciona solo parcialmente con los niveles de transcripción. La distancia del mediador al sitio de inicio de la transcripción difería para los promotores dependientes de SAGA y dependientes de TFIID. El reclutamiento del mediador dependía parcialmente de la subunidad Taf1 de TFIID en los promotores TFIID y SAGA y, a la inversa, los picos de ChEC-seq con Taf1 unido a Mnasa en el promotor central eran parcialmente dependientes del Mediador. ChEC-seq es un método simple y eficiente con alta resolución espacio-temporal y sensibilidad de orientación que anticipamos será ampliamente aplicable para el perfil de todo el genoma de la dinámica proteína-ADN.

        CUT & ampRUN: Recientemente hemos desarrollado un método de perfilado de cromatina ampliamente aplicable llamado CUT & ampRUN (escisión bajo el objetivo y liberación usando nucleasa) 19. Aquí, las células permeabilizadas intactas se incuban con un anticuerpo contra un factor de transcripción o modificación de histona, después de lo cual, una fusión de proteína A-MNasa dirige la escisión de la huella de cromatina. A diferencia de la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), CUT & ampRUN se realiza in situ en ausencia de reticulación de formaldehído sin fragmentación total del genoma y solubilización. Esto permite huellas de alta resolución de interacciones proteína-ADN con un fondo mínimo, tanto que podemos perfilar abundantes modificaciones de histonas con tan solo 100 células.

        Primero usamos CUT & ampRUN para mapear los factores de transcripción de levadura en ciernes Abf1 y Reb1 y comparamos los resultados con perfiles ORGÁNICOS 10. Encontramos una estrecha correspondencia de los sitios CUT y ampRUN con los sitios ORGÁNICOS con solo el 10% del número de lecturas paired-end. CUT & ampRUN asignaron los sitios Abf1 y Reb1 a una huella de 20 pb con una resolución de pares cercana a la base. Además de liberar pequeños fragmentos unidos al factor de transcripción, CUT & ampRUN también libera fragmentos más grandes protegidos por nucleosomas adyacentes, lo que permite un sondeo limitado de la estructura de la cromatina alrededor del sitio objetivo. CUT & ampRUN dirigido a complejos de cromatina más grandes, como el componente Sth1 del complejo RSC, dio resultados similares al perfil ORGÁNICO, pero con rendimientos mucho mayores. Al comparar las fracciones solubles e insolubles, pudimos mapear el cinetocoro insoluble utilizando la histona H3 (Cse4) específica del centrómero o incluso la fracción insoluble de H2A, que es máxima en los centrómeros.

        En células K562 humanas, Pete Skene aplicó CUT & ampRUN a los factores de transcripción CCCTC-binding factor (CTCF), Myc y Max. Los sitios de unión eran altamente concordantes con X-ChIP anterior del proyecto ENCODE o con nuestros propios datos 12, pero dieron un rango dinámico más alto. Se obtuvieron resultados similares dirigidos a dominios de la marca de cromatina represiva H3K27me3, que puede servir como un control positivo conveniente en experimentos CUT & ampRUN. La concordancia con ChiP entrecruzado sugiere que, al igual que X-ChIP, CUT y ampRUN pueden identificar sitios indirectos puestos en contacto con sitios directos a través de contactos proteína-proteína. CUT & ampRUN detectaron todos los sitios CTCF detectados por el ChIP nativo, que detecta solo sitios directos, pero también aproximadamente diez veces más sitios CTCF también presentes en X-ChIP que presumiblemente son de contactos indirectos. Para confirmar esto, comparamos los sitios CUT y ampRUN con los sitios de contacto CTCF ChiA-PET, encontrando que todos los fragmentos de ChiA-PET de alta puntuación se superponen con los sitios CUT y ampRUN directos e indirectos. Por lo tanto, comparar CUT & ampRUN con ChIP nativo puede distinguir contactos directos e indirectos con una resolución cercana al par de bases.

        Hemos seguido mejorando y adaptando nuestro protocolo. Derek Janssens automatizó CUT & ampRUN (AutoCUT & ampRUN) de modo que se pueda utilizar un formato de 96 pocillos para perfilar la cromatina para muestras de alto rendimiento, como en un entorno clínico 20. AutoCUT & ampRUN se utilizó para la actividad génica específica de tipo celular y el perfil potenciador de la línea de células madre embrionarias humanas H1 y la línea celular de leucemia K562, basándose en modificaciones de histonas y factores de transcripción que se correlacionan estrechamente con la actividad transcripcional. Auto CUT & ampRUN también se aplicó a muestras de tejido congelado de xenoinjertos tumorales, que estaban altamente correlacionados con las líneas celulares de glioma difuso de la línea media de las que derivaban, mientras que diferentes subtipos de tumores mostraron una actividad diferencial en 5000 promotores, lo que sugiere que las muestras congeladas pueden usarse para distinguir el tumor. subtipos 20.

        Terri Bryson construyó una fusión de proteína A-proteína G-MNasa marcada con 6xHis y HA (pAG-MNasa) que permite la unión directa de anticuerpos de ratón que se unen pobremente a la proteína A, eliminando la necesidad de un anticuerpo secundario 21. La etiqueta His permite la purificación de pAG-MNasa con un kit comercial, mientras que la etiqueta HA se puede utilizar para extraer complejos de cromatina pAG-MNasa para CUT y ampRUN.ChIP. Mike Meers desarrolló condiciones de bajo contenido de sal y alto contenido de calcio que evitan la difusión de los complejos liberados en el sobrenadante, lo que permite tiempos de digestión más largos y mayores rendimientos sin una mayor escisión en sitios accesibles no específicos. Mike también desarrolló Sparse Enrichment Analysis para CUT & ampRUN (SEACR), un algoritmo de llamada de picos que aprovecha la información de extensión de fragmentos y posiciones en los datos de CUT & ampRUN para mejorar la llamada de picos y la detección de dominios.

        CUT & ampTag: Hatice Kaya-Okur desarrolló una estrategia de anclaje enzimático similar para el perfil de cromatina de modificaciones de histonas, factores de transcripción y ARN polimerasa II, utilizando una fusión de proteína A con transposasa Tn5 precargada con adaptadores de secuenciación 22. La activación de la transposasa dentro de las células K562 liga los adaptadores a los fragmentos de cromatina alrededor del anticuerpo al que está unida la transposasa, y la amplificación de los fragmentos genera bibliotecas listas para secuenciar con alta resolución y muy bajo fondo. CUT & ampTag que usa anticuerpos para la ARN polimerasa II comprometida se validó mediante una estrecha correspondencia de los picos de CUT y ampTag con los datos de Pro-Seq que mapean el extremo 5 de las transcripciones de ARN polimerasa II mediante una metodología independiente. Usando anticuerpos para el factor de transcripción NPAT, que se une a los genes de histonas, o al factor abundante CTCF, la unión del factor de transcripción podría distinguirse fácilmente del corte no específico en la cromatina accesible, según lo determinado por ATAC-Seq, por la gran diferencia en cobertura de lectura entre sitios de unión conocidos y sitios ATAC-Seq. Hatice adaptó CUT & ampTag para el perfilado de células individuales de H3K27me3 mediante el uso de una centrifugación suave para recolectar células a granel entre los pasos en lugar de perlas magnéticas de Concanavalina A, seguido de la dispensación de células individuales en nanopozos de un chip de 5184 pocillos utilizando el sistema de nanodispensación ICELL8. A pesar de la escasez de datos, los perfiles de células individuales se encuentran dentro de los dominios H3K27me3 definidos por perfiles masivos.


        Introducción

        El ADN genómico está cubierto en gran parte por proteínas, principalmente en forma de nucleosomas. Gran parte del resto consiste en proteínas asociadas a la cromatina, incluidas las enzimas que modifican las histonas o el ADN, o catalizan el reordenamiento de los nucleosomas, y secuencias específicas de proteínas de unión al ADN (factores de transcripción) que median la activación o represión de genes. Una comprensión profunda de la regulación genética requiere una comprensión de cómo cada uno de estos coopera y compite por el acceso al ADN genómico.

        El hecho de que los nucleosomas y los TF compiten, de hecho, a escala genómica fue corroborado hace varios años por experimentos de microarrays de inmunoprecipitación de cromatina (chip-chip), que determinaron la distribución de histonas a lo largo del genoma de la levadura. [1] & # x02013 [3] Estos estudios revelaron una representación insuficiente de nucleosomas en las regiones promotoras, en relación con las regiones transcritas. Por el contrario, los TF están subrepresentados en las regiones transcritas y enriquecidos en las regiones promotoras. Además, la ocupación de nucleosomas difiere entre los promotores y estas diferencias se correlacionan con la probabilidad de unión de TF. [4]

        La competencia entre nucleosomas y factores de transcripción es una simple consecuencia de que cada uno tiene una probabilidad inherente de unirse al mismo sitio. Algunos factores de transcripción pueden unirse al ADN en la superficie exterior de un nucleosoma, pero la oclusión estérica de sitios en el interior y la curvatura pronunciada del ADN alrededor del nucleosoma impiden que la mayoría de los factores de transcripción se unan al ADN nucleosómico. Como consecuencia de esta competencia, los nucleosomas pueden mediar interacciones entre factores de transcripción (TF) de una manera completamente pasiva.Por ejemplo, un motivo de unión que está cerca de un segundo sitio ocupado por TF tenderá a tener una ocupación de nucleosomas más baja que en ausencia del sitio ocupado porque las configuraciones de nucleosomas que abarcan tanto el motivo como un sitio ocupado cercano son no permitido. Esta menor ocupación de nucleosomas se traduce en una mayor afinidad de unión efectiva del sitio. En este escenario, la unión cooperativa de factores no está mediada por interacciones directas entre los factores, sino por los efectos pasivos de los nucleosomas debido a la competencia mutua. Este efecto se ha demostrado experimentalmente. [5]

        La mediación pasiva de las interacciones TF-TF es una forma en que los nucleosomas afectan la ocupación de los TF en el genoma. Un segundo es a través de la especificidad de secuencia intrínseca de los propios nucleosomas. Los nucleosomas carecen de contactos de pares de cadenas laterales a bases de aminoácidos altamente específicos que son característicos de los factores de transcripción específicos de secuencia, pero tienen preferencias de secuencia que están determinadas por la capacidad del ADN para envolverse alrededor del nucleosoma. Una manifestación de esta preferencia es una tendencia sutil pero significativa hacia una periodicidad de 10 pb de ciertos pasos de dinucleótidos. [2], [6] & # x02013 [9] Esta periodicidad refleja la periodicidad helicoidal del ADN en los nucleosomas y las diferencias en la propensión a las perturbaciones estructurales entre los diferentes pasos de pares de bases-pares de bases. [10] Más recientemente, se ha llamado la atención sobre regiones ricas en A más largas, que inhiben la unión de nucleosomas [9], [11], [12]. La casi exclusión de estas secuencias de las regiones centrales de los nucleosomas se observó por primera vez aproximadamente al mismo tiempo que se descubrieron las preferencias de dinucleótidos [7], pero solo recientemente se ha hecho evidente que estas secuencias contribuyen sustancialmente a la capacidad de predecir la unión de nucleosomas. [9], [11], [12]

        Kaplan et al proporcionaron recientemente una demostración simple y elegante de que la especificidad de la secuencia intrínseca para la unión del nucleosoma es un determinante parcial del posicionamiento del nucleosoma in vivo. [9] En su trabajo, las posiciones de los nucleosomas se determinaron a partir de la secuenciación profunda de cromatina digerida por nucleasa preparada a partir de células de levadura, y también a partir de cromatina reconstituida in vitro a partir de histonas de pollo y ADN genómico de levadura. Se encontró que las características de la secuencia asociadas con la ocupación de nucleosomas son similares en la cromatina real y en la cromatina reconstituida. Además, los loci genómicos que están unidos por factores de transcripción tienen, en promedio, ocupaciones de nucleosomas más bajas que los sitios no unidos incluso cuando las ocupaciones de nucleosomas se determinan in vitro. Esto sugiere que las preferencias de unión de nucleosomas intrínsecos tienen algún efecto sobre la selección de sitios de unión por factores de transcripción in vivo. Kaplan et al informaron además que no hay diferencias significativas en las posiciones de los nucleosomas mapeados cuando la cromatina se reticuló en comparación con el procedimiento más convencional de mapeo sin reticulación. [9] El mapeo sin entrecruzamiento asume que los sitios ocupados por nucleosomas in vivo permanecen unidos a esos sitios en la escala de tiempo del ensayo. La similitud informada de los datos utilizando los dos procedimientos sugiere que ese es en gran parte el caso.

        Aquí, volvemos a visitar los datos de Kaplan et al, analizándolos en el contexto de los datos de chips ChIP existentes [13], así como nuevos experimentos más cuantitativos de ChIP-qPCR que se informan aquí. Confirmamos un papel de las preferencias de unión de nucleosomas intrínsecos en la unión de factores de transcripción, aunque nuestros análisis sugieren un límite bastante bajo sobre la cantidad de información que se puede proporcionar. Más interesante aún, mostramos que el papel desempeñado por la unión de nucleosomas específica de secuencia no radica tanto en el posicionamiento preciso de los nucleosomas como en la determinación de la densidad de nucleosomas promedio en una región del tamaño de un promotor. También mostramos que existe una diferencia entre la cromatina reticulada y no reticulada que es al menos tan informativa con respecto a la unión de factores de transcripción como cualquier conjunto de datos está solo.


        Resultados y discusión

        Extracto de los puertos de tejido cerebral de EA fijados con formaldehído y actividad inductora de amiloide # x003b2

        El extracto de cerebro fijado con formaldehído de dos casos confirmados de EA indujo enérgicamente la deposición de A & # x003b2 en cerebros de ratones jóvenes APP-tg 4 meses después de la inoculación intracerebral (Fig. 1). No se observaron tales depósitos de A & # x003b2 después de la infusión de un extracto de cerebro de control humano no demente fijado con formaldehído. El extracto de tejido fijo del caso 1 de AD produjo más deposición de A & # x003b2 sembrado que el extracto fijo del caso 2 de AD (Fig. 1c). En consecuencia, la tinción inmunohistoquímica de A & # x003b2 indicó que el caso 1 de AD tenía más deposición de A & # x003b2 (y, en particular, numerosas placas de núcleo denso y una deposición significativa de A & # x003b2 en la vasculatura) que el caso de AD 2. Sin A & # x003b2- Se encontraron depósitos en el donante de control (Figura complementaria 1).

        El tejido cerebral fijado con formaldehído de pacientes con EA induce amiloidosis cerebral & # x003b2-amiloidosis en huéspedes de ratón transgénico APP23. a, b Se inocularon intracerebralmente ratones jóvenes transgénicos APP23 (tg) de 3 & # x020134 meses de edad con extractos de tejido fijado con formaldehído de dos casos de AD (AD1 y AD2) o de un caso de control humano no demente (Ctr). Cuatro meses después de la inyección de extracto intrahipocampal (2.5 & # x003bcl), se indujo la deposición de A & # x003b2 en el hipocampo de ratones APP23 tg que recibieron extracto de AD (a). No se indujeron depósitos de A & # x003b2 por el extracto de cerebro de control (b). C Cuantificación estereológica del porcentaje de área del hipocampo ocupada por A & # x003b2 inmunorreactivo (carga A & # x003b2) inducida por extracto de los dos casos de EA y el caso de control (n = 3 & # x020136 ratones / grupo, media & # x000b1 SEM, escala barra: 200 & # x003bcm).

        El extracto de tejido cerebral de ratón fijado con formaldehído y cargado de amiloide también induce el depósito de amiloide & # x003b2

        Para corroborar la actividad inductora de amiloide del tejido cerebral humano fijado con formaldehído y que contiene amiloide, repetimos los experimentos de inoculación con extracto de cerebro de un ratón APPPS1 tg envejecido (22 meses). A esta edad, los ratones tg de APPPS1 exhiben amiloidosis cerebral extensa [27].

        Para este experimento, el cerebro de APPPS1 y un cerebro de un ratón de tipo salvaje (WT) de la misma edad se dividieron en el medio sagital en los dos hemisferios. Un hemisferio se fijó por inmersión en formaldehído mientras que el otro estaba recién congelado (sin fijar) (Fig. 2a). Se reveló SDS-PAGE y posterior inmunotransferencia A & # x003b2 de los sobrenadantes de homogeneizado de cerebro de 3000 & # x000d7 g

        20 veces menos A & # x003b2 monomérico / monomerizado (y también proteína total) en el extracto del hemisferio tg fijado con formaldehído en comparación con el extracto del hemisferio tg recién congelado (Fig. 2b), presumiblemente porque menos A & # x003b2 / se liberó proteína del tejido para entrar en el sobrenadante en las muestras fijadas (sólo una fracción insignificante del tejido fijado no entró en el gel). Para ajustar la diferencia en la cantidad de A & # x003b2 en los extractos, el material cerebral recién congelado se diluyó 1:20 para aproximar la concentración de A & # x003b2 en el extracto de cerebro fijo antes de la inyección intrahipocampal de los extractos en ratones APP23 tg. . La inmunotinción de A & # x003b2 4 meses más tarde reveló una fuerte inducción de amiloide & # x003b2 en el hipocampo de ratones que recibieron el extracto de cerebro de tg recién congelado diluido (1:20) (Fig. 2c). El extracto del hemisferio tg fijado con formaldehído también indujo la deposición de A & # x003b2 que era generalmente similar en patrón y morfología a la inducida por el extracto recién congelado (Fig. 2d). La cuantificación estereológica de la inmunorreactividad de A & # x003b2 reveló que el extracto de cerebro de ratón con tg fijada produjo menos deposición de A & # x003b2 que el extracto de cerebro diluido recién congelado, aunque esta diferencia no fue estadísticamente significativa (Fig. 2g). No se encontraron depósitos de A & # x003b2 después de la inoculación con extractos de hemisferios WT recién congelados o fijos (Fig. 2e yf).

        El tejido cerebral fijado con formaldehído de un donante de ratón APPPS1 envejecido induce amiloidosis cerebral y # x003b2-amiloidosis en huéspedes de ratón APP-tg. a Diagrama esquemático del protocolo de preparación de tejido en el que hemibrains de ratones tg APPPS1 envejecidos y ratones de tipo salvaje no tg (WT) se sometieron a fijación con formaldehído (& # x0201cfixed & # x0201d) o se congelaron recientemente (& # x0201cfresh & # x0201d). B El análisis de inmunotransferencia con un anticuerpo específico para A & # x003b2 humano (6E10) revela aproximadamente 20 veces menos A & # x003b2 recuperable (monomérico / monomerizado) en el extracto de cerebro del hemisferio tg fijo en comparación con el hemisferio tg recién congelado. c & # x02013f En vivo capacidad de siembra de extractos de cerebro recién congelados o fijados después de la inyección intrahipocampal en ratones APP23 tg de 3 & # x020134 meses de edad que se depositaron previamente. Los cerebros se analizaron inmunohistológicamente 4 meses después. Se encontró una deposición robusta de A & # x003b2 en la formación del hipocampo después de la inoculación con extracto del cerebro de tg recién congelado (diluido 1:20) (c). La deposición de A & # x003b2 también fue inducida por extracto de cerebro del cerebro de ratón tg fijado con formaldehído (d). Los extractos de cerebros WT frescos congelados (e) y fijos (f) no indujeron depósitos de A & # x003b2. gramo La cuantificación estereológica del porcentaje de área del hipocampo ocupada por A & # x003b2 inmunorreactivo (carga de A & # x003b2) reveló que la deposición inducida por el extracto del hemibrain tg fijo fue aproximadamente la mitad de la lograda con el extracto de tg diluido 1:20 del hemibrain hemibrain fresco congelado. ANOVA (genotipo del material del donante & # x000d7 preparación de tejido) reveló un efecto significativo del genotipo del donante (F (1, 16) = 33,64 p & # x0003c0.001) pero ningún efecto significativo de la preparación del tejido (F (1, 16) = 3.282 p = 0.089) o interacción (F (1, 16) = 3.582 p = 0.077) (n = 4 & # x020136 ratones / grupo promedio & # x000b1 SEM, barra de escala: 200 & # x003bcm).

        El probable factor inductor de amiloide & # x003b2 en extractos cerebrales fijos es probablemente similar al del material cerebral recién congelado, previamente identificado como especies A & # x003b2 que varían en tamaño desde oligómeros solubles hasta A & # x003b2 fibrilar [19, 20]. Sin embargo, debido a que las condiciones de desnaturalización en SDS-PAGE tienden a alterar el estado de la proteína nativa y monomerizar los ensamblajes multiméricos, la naturaleza precisa de las semillas biológicamente activas en el material fijado (y si difieren de las semillas en el estado nativo) queda por determinar. .

        A continuación, se probaron extractos de tres ratones tg APPPS1 y ratones WT adicionales (fijos y recién congelados, todos de 20 & # x0201322 meses de edad) en un in vitro ensayo de agregación. Los resultados confirmaron tanto la en vivo capacidad de siembra de homogeneizados de cerebro fijados con formaldehído, así como la eficacia reducida del material fijado (Fig. 3). Además, al igual que con los donantes de tejido APPPS1, el extracto de cerebros fijos de ratones tg APP23 envejecidos (25 & # x0201327 meses de edad) también mostró actividad de siembra in vitro ( Fig. 3 ).

        El material cerebral fijado con formaldehído de ratones transgénicos con APP tiene capacidad de siembra in vitro. Se controló la cinética de fibrilación de A & # x003b21 & # x0201340 recombinante mediante la incorporación de tioflavina T (ThT). Los tiempos de demora se determinaron como medidas de la capacidad de siembra de los extractos. Tanto el tejido cerebral APP23 como el tejido cerebral APPPS1 muestran una reducción in vitro actividad de siembra en respuesta a la fijación de formaldehído (n = 4 / grupo). Tenga en cuenta que los extractos recién congelados no se diluyeron en este experimento (compárese también con la Fig. 2). Los extractos de cerebros de ratón tanto de APP23 fija como de APPPS1 fija todavía muestran una fuerte actividad de siembra en comparación con los extractos de cerebro de tipo salvaje (WT) fijados (o congelados en fresco) (n = 3 / grupo). Cada punto de datos representa el tiempo de retraso medio de un extracto de cerebro individual determinado por la medición de ocho réplicas técnicas, con la siembra de todos los extractos medidos dos veces, con la excepción de los extractos de tres ratones donantes que se midieron solo una vez. La media de cada grupo se indica con una línea negra. ANOVA (genotipo del material del donante & # x000d7 preparación de tejido con valores fijos comparados frente a valores frescos) reveló un efecto significativo del genotipo del donante (F (2, 8) = 124,8 p & # x0003c0,001), preparación de tejido (F (1, 8) = 759,9 p & # x0003c0,001) e interacción (F (2, 8) = 256,1 p & # x0003c0,001). Las pruebas posteriores de comparación múltiple de Tukey & # x02019s revelaron que los tiempos de retraso asociados con extractos de cerebro de ratón tanto de APP23 fijos como de APPPS1 fijos eran más cortos en comparación con los tiempos de retraso en presencia de extractos de cerebro de WT fijos (todos ps & # x0003c0.001). De manera similar, los tiempos de retardo producidos por extractos de cerebro de ratón APP23 y APPPS1 recién congelados fueron significativamente más cortos en comparación con los asociados con extractos de cerebro WT recién congelados (todos ps & # x0003c0,001).

        La fijación con formaldehído conserva las propiedades similares a las deformaciones de las placas sembradas A & # x003b2

        Las placas de A & # x003b2 en diferentes líneas de ratones APP-tg varían en apariencia y arquitectura molecular, mientras que los depósitos de A & # x003b2 en ratones APP23 tg de edad son bastante grandes con núcleos congofílicos y penumbras difusas, las placas A & # x003b2 en ratones APPPS1 tg de edad son pequeñas y compactas y altamente congofílico [13, 20]. Mediante experimentos de inoculación cruzada, demostramos previamente que tales morfotipos de placa A & # x003b2 se pueden mantener mediante conversión sembrada, es decir, las semillas de APPPS1 inyectadas en un huésped APP23 inducen depósitos de A & # x003b2 que recuerdan a las placas A & # x003b2 endógenas en ratones APPPS1 de edad avanzada, mientras que Las semillas de APP23 inyectadas en un huésped de APP23 inducen depósitos de A & # x003b2 que recuerdan a las placas de A & # x003b2 en ratones APP23 de edad [13].

        Para investigar si este fenómeno de conversión de plantilla congruente también se aplica al material cerebral fijo, se inyectaron intracerebralmente extractos de hemisferios de APPPS1 y APP23 fijados y recién congelados en ratones tg de APP23 jóvenes, respectivamente. El análisis inmunohistoquímico 4 meses después de la inoculación reveló los morfotipos esperados de A & # x003b2 que resultan de las inyecciones de extractos cerebrales recién congelados (es decir, placas A & # x003b2 con penumbras difusas para ratones APP23, y depósitos pequeños y compactos para ratones APPPS1, Fig. 4a y b ). Sin embargo, los extractos de donantes fijos de ratones tg APP23 y APPPS1 dieron lugar a placas A & # x003b2 que eran bastante pequeñas y compactas (Fig. 4c yd). Posteriormente, se utilizaron oligotiofenos conjugados luminiscentes (LCO) para investigar más a fondo si el amiloide inducido por extractos de cerebros fijos puede distinguirse por sus espectros de emisión, como se mostró anteriormente para inyecciones de material cerebral recién congelado [13]. Los resultados cuantitativos revelaron que pFTAA discrimina espectralmente entre depósitos de A & # x003b2 en ratones que fueron inyectados con APP23 recién congelada o extracto de cerebro de APPPS1 recién congelado (Fig. 4e), de acuerdo con estudios previos [13]. El análisis espectral de las placas inducidas por la inyección de extractos de cerebro de APP23 fijados o de APPPS1 fijos también mostró una diferencia significativa (Fig. 4e). Estos datos indican que la fijación de formaldehído modifica parcialmente el aspecto histológico de la morfología de la placa A & # x003b2 sembrada, pero al mismo tiempo mantiene al menos algunas de las propiedades conformacionales básicas del A & # x003b2 agregado.

        La fijación con formaldehído conserva las propiedades de deformación de las placas A & # x003b2 sembradas. Se inyectaron intracerebralmente extractos de cerebro de ratones donantes APPPS1 o APP23 tg envejecidos (los extractos eran de dos ratones donantes cada uno) en ratones hospedadores APP23 tg de 3 & # x020134 meses antes del depósito. Los cerebros se analizaron 4 meses después de la inoculación usando inmunotinción de A & # x003b2. a & # x02013d El extracto de tejido cerebral de APP23 recién congelado indujo un patrón más difuso de depósito de A & # x003b2 (a), mientras que el extracto de tejido cerebral de APPPS1 recién congelado indujo un modelo más punteado de depósito de A & # x003b2 (b). La inyección de extractos de tejido cerebral fijado con formaldehído indujo un patrón más punteado para los ratones donantes tanto de APP23 (c) como de APPPS1 (d) (barra de escala: 200 & # x003bcm). mi Propiedades espectrales de los depósitos de A & # x003b2 inducidos usando oligotiofenos conjugados luminiscentes (pFTAA). Para el análisis cuantitativo, se calculó la relación de la intensidad de la luz emitida a 492 nm y 599 nm (ver Métodos). Cada punto representa una placa A & # x003b2. La media y SEM se indican para cada animal (n = 3 & # x020134 / grupo). ANOVA (genotipo del material del donante & # x000d7 preparación de tejido) reveló un efecto significativo del genotipo del donante (F (1, 9) = 165,6 p & # x0003c0.001) pero ningún efecto significativo de la preparación del tejido (F (1, 9) = 4.856 p = 0.055) o interacción (F (1, 9) = 3.947 p = 0.078).

        Una característica importante de los priones es su resistencia a la inactivación mediante tratamientos físicos y químicos que neutralizan la mayoría de los microbios y virus [5, 23, 25, 29]. Aunque los virus varían en su sensibilidad al tratamiento con formaldehído [2], la infectividad persistente de los priones incluso después de la exposición al formaldehído [10] durante meses o años [4, 23, 24] fue una de las primeras indicaciones de que el agente causante de la tembladera era a diferencia de los agentes infecciosos convencionales [23]. Aquí demostramos que las semillas de A & # x003b2, como los priones, son resistentes a la inactivación por el formaldehído. Específicamente, el material cerebral que contenía A & # x003b2 agregado de ratones APP-tg (fijado durante 48 h) o de casos humanos de EA (fijado por hasta 2 años) retuvo la capacidad de sembrar la deposición de A & # x003b2 cuando se infundió en los cerebros de APP- ratones hospedadores tg. No se sabe que las semillas de A & # x003b2 sean infecciosas en el sentido de fácil transmisibilidad de un organismo a otro [16]. Sin embargo, a la luz de estudios previos que muestran que las semillas de A & # x003b2 siguen siendo funcionales después de la ebullición [20] o el secado [8], estos hallazgos subrayan aún más sus similitudes moleculares con los priones.

        La eficacia de siembra del tejido fijado fue menor que la del tejido no fijado comparable, posiblemente debido a la liberación reducida de A & # x003b2 de las muestras fijadas durante la homogeneización, como se muestra por el análisis de inmunotransferencia de los extractos (Fig. 2b). También es posible que la fijación disminuya adicionalmente la eficacia inductiva de las semillas de A & # x003b2 corrompiendo su estructura molecular, aunque los LCO indican que la fijación de formaldehído conserva en gran medida las propiedades de tipo cepa del amiloide inducido. La pérdida de inmunotinción difusa de A & # x003b2 en las penumbras de las placas que se indujeron con extracto de cerebros de APP23 fijados en comparación con los recién congelados puede indicar que varias especies de A & # x003b2 son diferencialmente sensibles a la fijación de formaldehído.

        A & # x003b2 en tejido fijado es parcialmente resistente a la digestión por proteinasa K (datos no publicados), lo que sugiere que la fijación puede actuar para inmovilizar y proteger las semillas de A & # x003b2 de la degradación proteolítica. Curiosamente, la fijación tisular mediante formaldehído puede proteger a los priones contra la inactivación por esterilización en autoclave [5, 33], aunque la desnaturalización con ácido fórmico neutraliza eficazmente los priones en el tejido fijado [6, 32]. El ácido fórmico también niega la capacidad amiloidogénica de las semillas A & # x003b2 en tejido no fijado [20]. Dada la eficacia del ácido fórmico contra la infectividad de los priones, parece probable que el ácido fórmico también neutralice las semillas de A & # x003b2 en tejido fijo, pero esta posibilidad queda por probar.Es importante destacar que la resistencia de los priones a los métodos estándar de inactivación ha provocado mejoras en la esterilización de instrumentos médicos y prácticas generales de manipulación de tejidos sospechosos de albergar priones [29]. Como resultado, la transmisión iatrogénica de la enfermedad priónica a los seres humanos prácticamente ha cesado [3].

        Conclusiones

        Nuestros experimentos muestran que las semillas de A & # x003b2 en extractos de tejido cerebral conservan la capacidad de inducir amiloidosis & # x003b2 incluso después de una exposición prolongada (2 años) al formaldehído. Además, las semillas fijadas con formaldehído retuvieron en gran medida su capacidad conformacional de plantilla, ya que los depósitos de amiloide nacientes replicaron las propiedades espectrales de las semillas parentales, al menos en los sitios de unión de los ligandos de oligotiofeno sensibles a la conformación. El descubrimiento de que tanto la actividad de autopropagación como las características de tipo cepa de A & # x003b2 agregadas se mantienen en tejido fijo apoya además la incorporación de semillas de A & # x003b2 en el amplio marco conceptual de los priones. Además, ahora se puede aprovechar la estabilidad de las semillas en material fijo para establecer la relación entre la arquitectura molecular de A & # x003b2 y las características clínicas variables de la EA, incluso en muestras de cerebro archivadas y fijadas con formalina. Aunque las semillas de A & # x003b2 pueden persistir en tejido fijo, las implicaciones para la práctica estándar de laboratorio son inciertas. Actualmente, el peso de la evidencia, aunque en su mayoría circunstancial, argumenta en contra de la infectividad exógena de las semillas de A & # x003b2 en la EA [15, 16]. Más bien, la EA parece surgir espontáneamente debido a la emergencia endógena y la autopropagación de semillas de proteínas patógenas. Los presentes hallazgos destacan la extraordinaria robustez de las semillas A & # x003b2 una vez que se afianzan en el cerebro, su resistencia a la destrucción facilita la formación y propagación endógena de nuevas semillas, lo que mantiene el proceso de la enfermedad.


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