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7.12: Herramientas de Ingeniería Genética - Biología


7.12: Herramientas de ingeniería genética

Las 4 herramientas principales de la ingeniería genética

La creación de una biblioteca genómica implica la clonación de ADN genómico completo. Por lo tanto, una biblioteca genómica es una colección de moléculas de ADN recombinante (plásmidos, fagos) de modo que la suma total de insertos de ADN en esta colección representa el genoma completo del organismo. Dependiendo del tamaño del genoma, procariota o eucariota, se puede seleccionar el vector. De esta manera, el genoma completo se puede cortar en pedazos y clonar en vectores o mediante la técnica de PCR. Esto puede denominarse clonación genómica.

La creación de una biblioteca genómica incluye los siguientes pasos:

1. Aislamiento de ADN cromosómico

2. La fragmentación del ADN se lleva a cabo mediante cizallamiento mecánico o sonicación o utilizando una endonucleasa adecuada para la digestión parcial del ADN (Fig. 15.1). El cizallamiento mecánico genera extremos romos mientras que la endonucleasa produce extremos cohesivos. Se evita la digestión completa ya que genera fragmentos de tamaño demasiado heterogéneo para ser utilizados.

3. Ligadura de fragmentos de ADN: la digestión parcial de ADN genómico se somete a electroforesis en gel de agarosa para la separación de los fragmentos del tamaño requerido. Los fragmentos de tamaño apropiado se eluyen del gel. A continuación, estos fragmentos se insertan en un vector adecuado. Estos vectores se cortan con las mismas enzimas de restricción. Después de eso, los fragmentos de ADN se ligan en un vector usando ADN ligasa (Fig. 15.2). Mediante esta técnica, se pueden insertar fragmentos de ADN de aproximadamente 25 kb en vectores.

4. Identificación del clon deseado: identificación de la colonia bacteriana que contiene el fragmento de ADN deseado mediante el empleo de una sonda de hibridación adecuada en la hibridación de colonias. La sonda puede ser ARNm del gen, ADNc de su ARNm, gen homólogo de otro organismo o un oligonucleótido sintético que representa la secuencia de una parte del gen / fragmento de ADN deseado. Para detectar la hibridación, la sonda debe marcarse normalmente con un isótopo radiomarcado.

Sistemas de vectores alternativos para hacer una biblioteca genómica:

Para procariotas (genomas más pequeños) viables para hacer bibliotecas de genes en plásmidos. Los plásmidos se insertan normalmente de -5-10 kb, por lo que solo se necesitan unos pocos miles de recombinantes para una biblioteca representativa. Los eucariotas (genomas más grandes) realmente necesitan vectores que puedan contener fragmentos de ADN de inserción mucho más grandes (tabla 15.1).

El bacteriófago lambda muestra una infección de E. coli mucho más eficaz que la que se puede conseguir mediante la transformación del plásmido. El fago lambda se une a los receptores en la superficie de E. coli e inyecta ADN. La infección por lambda es mucho más eficiente que la transformación de plásmido & # 8211 puede conseguir

109 placas por microgramo de ADN, vs.

106 colonias por microgramo de ADN plasmídico.

A medida que las células bacterianas se lisan, se forma una placa que se propaga a medida que más células se infectan y lisan. La placa contiene las partículas virales infecciosas o viriones y cada una representa un clon lambda individual (similar a una colonia bacteriana que representa un clon plásmido individual).

La apariencia es de un círculo claro en una & # 8216cloud & # 8217 de células bacterianas (la & # 8216lawn & # 8217 bacteriana) (Fig. 15.3). Si se incuban durante períodos prolongados, estos círculos seguirán creciendo (conteniendo cada vez más partículas virales) y se extenderán hasta que se eliminen todas las células bacterianas. Para elegir un solo clon lambda, la placa se & # 8216 perfora & # 8217 de la placa de agar y se almacena en una solución de retención. Esto se puede usar para infectar más células bacterianas y replicar más ADN lambda recombinante.

Vectores para crear bibliotecas con inserciones más grandes:

Las bibliotecas de cósmidos se utilizan para clonar genes con intrones grandes y para secuenciar fragmentos más grandes del genoma. Los vectores cósmidos son híbridos de ADN plasmídico y bacteriófago lambda λ (un pequeño

Plásmido de 5 kb que contiene el origen de replicación del plásmido (ori), un gen de resistencia a antibióticos como amp y un sitio de restricción adecuado para la clonación junto con la secuencia COS del ADN del fago λ). Debido a la secuencia COS, los recombinantes de cósmidos se pueden empaquetar en partículas virales (lo que permite una transformación de alta eficiencia).

Dado que la mayoría de las bibliotecas genómicas en el vector cósmido, el ADN λ se ha descartado, puede ser reemplazado por el ADN de interés, siempre que no exceda el límite de 50 kb para el empaquetamiento en la cabeza viral. Los tamaños de plaquita son del orden de 35-45 kb. Dado que el ADN recombinante no codifica ninguna proteína lambda, los cósmidos no forman partículas virales (o placas) sino que forman grandes plásmidos circulares y las colonias que surgen se pueden seleccionar en placas de antibióticos, como otros transformantes de ADN plasmídico.

Los clones de cósmidos se pueden manipular de forma similar, lo que facilita el aislamiento del plásmido. Dado que muchos genes eucariotas son del orden de 30 & # 8211 40 kb, la probabilidad de obtener un clon de ADN que contenga la secuencia completa del gen aumenta significativamente cuando se usa una biblioteca de cósmidos.

Las bibliotecas YAC se utilizan para clonar fragmentos de ADN muy grandes (de más de 1 Mb) y son útiles para clonar genes grandes (como el gen de la fibrosis quística de 250 kb) y para crear bibliotecas de clones grandes superpuestos, como para cromosomas individuales aislados. de organismos (bibliotecas cromosómicas). Estos se han utilizado ampliamente para mapear genomas de organismos complejos (por ejemplo, Homo sapiens).

Los YAC son cromosomas artificiales de levadura y son híbridos de ADN plasmídico bacteriano y ADN de levadura. Los componentes necesarios para la replicación / segregación de los cromosomas de levadura naturales se han combinado con el ADN plasmídico de E. coli. Los YAC se cultivan en la levadura Saccharomomyces cerevesiae y, por tanto, contienen marcadores seleccionables que son adecuados para el sistema huésped. En lugar de la selección de antibióticos, los marcadores seleccionables de levadura permiten el crecimiento del transformante en medios selectivos que carecen de nutrientes específicos. (Los no transformantes no pueden crecer). Las cepas de levadura que se utilizan son auxótrofas, es decir, no pueden producir un compuesto específico.

Por ejemplo, los mutantes Trpl pueden producir triptófano, por lo que solo pueden crecer en medios complementados con triptófano. Si la cepa mutante se transforma con un YAC que contiene un gen Trpl intacto, esto compensará el gen inactivo (complemento) y la célula transfectada podrá crecer en medios que carecen de triptófano.

Los YAC ya no se utilizan con tanta frecuencia debido a problemas inherentes. Por ejemplo, los clones de YAC pueden contener segmentos no contiguos del genoma. Esto significa que 2 o más fragmentos de ADN de partes separadas del genoma pueden integrarse en un YAC individual (porque pueden soportar insertos bastante grandes). Un segundo problema es que los YAC son inestables y con frecuencia pierden partes del ADN durante la propagación.

Las bibliotecas de BAC también se utilizan para clonar fragmentos de ADN muy grandes y han sido particularmente útiles para secuenciar genomas grandes. Los BAC son cromosomas artificiales bacterianos y se basan en un gran plásmido bacteriano natural, el factor F. Los vectores BAC pueden acomodar inserciones de ADN de hasta 300 kb, lo que sigue siendo bastante respetable cuando se necesita clonar genes grandes o mapear y secuenciar genomas complejos. Los BAC tienen varias ventajas sobre los YAC, lo que significa que ahora se utilizan más ampliamente. La mayor parte del genoma humano se ha secuenciado utilizando clones BAC en lugar de YAC.

Herramienta # 2. cDNA y cDNA Lbiblioteca:

El ADN complementario (ADNc) es ADN sintético elaborado a partir de ARNm con el uso de una enzima especial llamada transcriptasa inversa (ADN polimerasa dependiente de ARN descubierta por Temin y Baltimore en 1970). Originalmente, esta enzima se aisló de reterovirus. Esta enzima realiza reacciones similares a la ADN polimerasa y requiere un cebador con un terminal OH 3 & # 8242 libre. Con el uso de un ARNm como molde, la transcriptasa inversa sintetiza una molécula de ADN monocatenario que luego puede usarse como molde para el ADN bicatenario (figura 15.4). Debido a que está hecho de ARNm, el ADNc está desprovisto de secuencias reguladoras tanto aguas arriba como aguas abajo y de intrones.

Esto significa que el cDNA de eucariotas puede traducirse en proteína funcional en bacterias, una característica importante cuando se expresan genes eucariotas en un huésped bacteriano. Una cadena corta de oligo (dT) se hibrida con la cola poli (A) de la hebra de ARNm. El segmento oligo (dT) sirve como cebador para la acción de la transcriptasa inversa, que utiliza el ARNm como molde para la síntesis de la cadena de ADNc. El ADNc resultante termina en un bucle de horquilla. Cuando el ARNm, del híbrido ARN-ADN, se ha degradado mediante el tratamiento con NaOH o ARNasa H, queda una pequeña porción de ARN. Este lazo de horquilla se convierte en un cebador para la ADN polimerasa I, que completa la hebra de ADN emparejada.

A continuación, el bucle se escinde por la nucleasa SI (que actúa solo en el bucle monocatenario) para producir una molécula de ADNc bicatenario. Este ADN de doble hebra se puede insertar en plásmidos, cósmidos, fagos lambda, vectores de clonación mediante ligación de extremos romos.

Una biblioteca de ADNc es una población de transformantes bacterianos o lisados ​​de fagos en la que cada ARNm aislado de un organismo o tejido se representa como su inserción de ADNc en un plásmido o un vector de fago. La frecuencia de ADNc específico en tal biblioteca dependería de la frecuencia del ARNm en cuestión en ese tejido.

Herramienta # 3. Análisis de genes y transcripciones de genes:

La tecnología del ADN recombinante implica la localización del gen de interés. Este gen se puede aislar o sintetizar antes de manipularlo y utilizarlo para la transformación que conduzca a la producción de plantas y animales transgénicos. Se han utilizado diferentes técnicas para el aislamiento de diferentes variedades de genes como el gen del ARN ribosómico, el gen para rasgos fenotípicos con producto génico desconocido, para productos proteicos específicos y genes implicados en funciones reguladoras, p. genes promotores, etc.

Aislamiento de genes de ARN ribosómico:

El ARN ribosómico produce el 80% del ARN total y se sintetiza en el gen ribosómico que podría aislarse. El aislamiento de este gen fue fácil debido a algunas características características del ARNr (a) los genes ribomsómicos están presentes en múltiples copias (b) la diferencia entre los genes ribosómicos y otros genes, debido a su contenido relativamente alto de G + C en el ARNr. El gen ribosómico fue aislado por primera vez en 1965 por H. Wallace y M.L. Birnstiel en un anfibio llamado Xenopus.

Los diferentes pasos involucrados en el aislamiento de genes de ARNr son los siguientes:

1. El ARNr se aísla de los ribosomas y se hace radiomarcado al permitir que se repliquen en un medio que contiene uridina tritiada.

2. El ADN ribosómico se aísla mediante centrifugación en gradiente de densidad (el alto contenido de G + C del ADNr facilita su separación por centrifugación del resto del ADN) seguido de su desnaturalización.

3. A continuación, se fija el ADN monocatenario en papel de filtro y se añade al papel ARN etiquetado.

4. Ahora se produce la hibridación de ADN y ARN y el exceso de ARN marcado se elimina por lavado.

5. Se mide la radiactividad y se obtiene un híbrido dúplex que, tras la desnaturalización, dará un ADN monocatenario que puede convertirse en bicatenario. Así es como se puede aislar el gen del ARNr.

Aislamiento de genes de proteínas específicas:

Esto es posible mediante el uso de enzima transcriptasa inversa. Esta enzima puede hacer una copia / ADN complementario (ADNc) a partir del ARN. Por tanto, es necesario disponer de técnicas para el aislamiento de ARNm.

Los diferentes pasos involucrados son los siguientes:

1. Se purifica el producto proteico del gen.

2. Se producen anticuerpos contra estos productos proteicos mediante la inmunización de animales como el conejo y el ratón.

3. Se realiza la precipitación de polisomas que se dedican a sintetizar proteínas específicas. Esto se hace con la ayuda de los anticuerpos producidos.

4. El ARNm se aísla y se purifica a partir de las fracciones de polisoma. Este ARNm se utiliza para sintetizar ADNc.

5. A continuación, estos ADNc se insertan en vectores de clonación para la preparación de la biblioteca de ADNc. Posteriormente, se realiza el análisis inmunológico y electroforético de los productos de traducción de los clones de cDNA, para identificar el clon de cDNA específico, que tiene gen para la proteína específica de interés.

6. A continuación, se seleccionan sondas de ADNc específicas para la identificación y aislamiento del gen del ADN genómico mediante el cribado de una biblioteca genómica completa o parcial.

Aislamiento de genes de productos desconocidos (con expresión específica de tejido):

Es fácil aislar los productos génicos que son específicos de tejido. Por ejemplo, los genes para las proteínas de almacenamiento se expresan solo en semillas en desarrollo, el gen de la globina se expresa en los eritrocitos. Tales genes pueden aislarse fácilmente porque el ARNm extraído de dicho tejido será en gran parte un gen de interés. Se pueden eliminar otros ARNm, que se pueden identificar por aislamiento y comparación de ARNm del tejido donde este gen no se expresa. Luego, este ARNm aislado se usa para la síntesis de ADNc usando la enzima transcriptasa inversa. Entonces, el proceso es el mismo que se describe en el aislamiento de genes que codifican proteínas específicas conocidas.

Aislamiento de genes mediante sondas de ADN y ARN:

Si las sondas moleculares específicas (sondas de ADN y ARN) están disponibles, pueden usarse para el aislamiento de genes específicos. Estas sondas pueden obtenerse de otra especie vegetal o pueden sintetizarse artificialmente usando una parte de la secuencia de aminoácidos del producto proteico del gen de interés. Las sondas obtenidas de una especie vegetal y utilizadas para otra especie vegetal se denominan sondas heterólogas.

Se ha descubierto que estas sondas heterólogas son eficaces para identificar clones de genes durante la hibridación de colonias o la hibridación de placas o en la transferencia Southern. Por ejemplo, el gen de la calcona sintasa se ha aislado de Antirrhinum majus y Petunia hybrida usando una sonda heteróloga de parsely. Las sondas heterólogas se utilizan generalmente con la biblioteca de ADNc.

Ahora, con nuestro conocimiento de la síntesis de sondas de ADNc, estas sondas pueden ser útiles en la síntesis de sondas sintéticas. En este procedimiento, la proteína purificada usando la electroforesis en gel bidimensional se usa para la microsecuenciación de 5-15 aminoácidos consecutivos, esta información se puede usar para la síntesis de los oligonucleótidos correspondientes usando sintetizadores de ADN automatizados. A continuación, estos oligonucleótidos pueden utilizarse directamente para el cribado de ADNc o biblioteca genómica para el aislamiento del gen de interés.

Herramienta # 4. Hibridación de colonias:

La hibridación de colonias es el cribado de una biblioteca con una sonda marcada (radiactiva, bioluminiscente, etc.) para identificar una secuencia específica de ADN, ARN, enzima, proteína o anticuerpo (figura 15.5).

La hibridación tiene dos características importantes:

1. Las reacciones de hibridación son sondas específicas que se unirán solo a sitios que tengan secuencias complementarias.

2. Las reacciones de hibridación ocurren en presencia de grandes cantidades de moléculas que son similares pero no idénticas al sitio. Esto significa que una sonda puede encontrar una molécula de objetivo en una mezcla de millones de moléculas relacionadas pero no complementarias.

Esta especificidad permite encontrar una secuencia específica en una mezcla compleja llena de secuencias similares. Una técnica de hibridación también permite a los científicos seleccionar la molécula de interés de mezclas muy complejas y estudiar la molécula por sí misma.

Método de hibridación de colonias:

Se requieren los siguientes pasos:

1. Aislar y hacer crecer los cultivos en un medio adecuado (agar).

2. Transfiera una muestra de las colonias a una matriz sólida, como una membrana de nitrocelulosa o nailon.

3. Las células de la membrana se lisan y luego se desnaturaliza el ADN.

4. Se agrega una sonda marcada a la matriz y tiene lugar la hibridación.

5. La matriz se enjuaga para eliminar las moléculas sonda no hibridadas.

6. Para las sondas radiactivas, se usa autorradiografía y la matriz se coloca en una película de rayos X.

7. Se observa la película en busca de puntos negros que corresponden a colonias que hibridaron con la sonda.

8. Compare la película de rayos X con la placa maestra para ver qué colonias tuvieron hibridación de sonda. Estas son las colonias que contenían la secuencia específica que realmente se hibridó con la sonda.

9. Las colonias en la placa maestra que tienen la secuencia deseada pueden luego subcultivarse si se desea.

Ventajas:

1. Le permite elegir una molécula de interés entre millones.

2. No requiere el aislamiento de ácidos nucleicos.

3. Es posible cultivar e identificar microorganismos que contienen la secuencia hibridada.

Desventajas:

1. Requiere mucho tiempo, para que las colonias se incuben y para que la hibridación se muestre en la película de rayos X.

2. Al identificar microorganismos, el procedimiento solo funcionará si los organismos crecen y forman una colonia detectable.


A continuación, se muestra una lista de las herramientas / enzimas moleculares de un ingeniero genético que se utilizan con más frecuencia en los experimentos de ingeniería genética:

1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es el proceso de replicar múltiples copias de los genes de interés. El descubrimiento de ADN polimerasas termoestables, como Taq La polimerasa ha permitido manipular la replicación del ADN en el laboratorio. Amplifica las cantidades de segmentos de ADN. Los cebadores se utilizan para identificar el gen de interés y replicarlo. A continuación, estas copias se pueden separar y purificar mediante electroforesis en gel.

2. Enzimas de restricción (tijera molecular)

El descubrimiento de enzimas conocidas como endonucleasas de restricción ha sido esencial para la ingeniería de proteínas. Según la secuencia de nucleótidos, estas enzimas cortan el ADN en ubicaciones específicas. El ADN cortado con una enzima de restricción produce muchos fragmentos más pequeños de diferentes tamaños. Estos pueden separarse mediante electroforesis en gel o cromatografía.

3. Electroforesis en gel

Purificar el ADN de un cultivo celular o cortarlo con enzimas de restricción no sería de mucha utilidad si no pudiéramos visualizar el ADN. La electroforesis en gel ayuda a visualizar el tamaño y el tipo de ADN extraído mediante PCR y enzimas de restricción. También se utiliza para detectar insertos y knockouts de ADN.

4. ADN ligasa

La ADN ligasa puede crear enlaces covalentes entre cadenas de nucleótidos. Esto se hace para crear hebras recombinantes o cerrar una hebra circular que ha sido cortada por enzimas de restricción. Las enzimas ADN polimerasa I y polinucleótido quinasa también son importantes para rellenar huecos o fosforilar los extremos 5 ', respectivamente.

5. Plásmidos

Los plásmidos son pequeñas piezas circulares de ADN que no forman parte del genoma bacteriano pero que son capaces de autorreplicarse. Se utiliza como vector para transportar genes entre microorganismos. Una vez que el gen de interés se ha amplificado con PCR, el gen y el plásmido se cortan mediante enzimas de restricción y se ligan. La combinación resultante se conoce como ADN recombinante. El ADN viral (bacteriófago) también se puede usar como vector, al igual que los cósmidos, que son plásmidos recombinantes que contienen genes de bacteriófagos.

6. Transformación / Transducción

Transformación es el proceso de transferir material genético en un vector, como un plásmido, a las células huésped. Las células huésped están expuestas a un cambio ambiental, como la electroporación, que las hace "competentes" o temporalmente permeables al vector. Cuanto más grande es el plásmido, menor es la eficacia con la que lo absorben las células.

Los segmentos de ADN más grandes se clonan más fácilmente utilizando bacteriófagos, retrovirus u otros vectores virales o cósmidos en un método llamado Transducción. Los vectores fagos o virales se utilizan a menudo en la medicina regenerativa, pero pueden provocar la inserción de ADN en partes de nuestros cromosomas donde no lo deseamos, provocando complicaciones e incluso cáncer.

7. Identificación de organismos transgénicos

No todas las células absorberán ADN durante la transformación. Por tanto, es fundamental identificar las células que sufren una transformación y las que no. Generalmente, los plásmidos portan genes de resistencia a antibióticos y las células transgénicas pueden seleccionarse basándose en la expresión de esos genes y su capacidad para crecer en medios que contienen ese antibiótico. Los métodos alternativos de selección dependen de la presencia de otras proteínas informadoras como la x-gal /lacZ sistema, o proteína de fluorescencia verde, que permiten la selección basada en el color y la fluorescencia, respectivamente.


Aplicaciones de la ingeniería genética [volver arriba]

Esta sección contiene información adicional que no se incluye directamente en AS Biology. Sin embargo, puede ser útil para ayudar a respaldar y consolidar las técnicas de GE.

Ahora hemos examinado algunas de las muchas técnicas utilizadas por los ingenieros genéticos. ¿Qué se puede hacer con estas técnicas? Con mucho, las aplicaciones más numerosas siguen siendo herramientas de investigación, y las técnicas anteriores están ayudando a los genetistas a comprender los sistemas genéticos complejos. A pesar de todo el bombo publicitario, la ingeniería genética todavía tiene muy pocas aplicaciones comerciales exitosas, aunque estas aumentan cada año. Las aplicaciones hasta ahora pueden ser consideradas de manera útil en tres grupos.

utilizando organismos genéticamente modificados (generalmente microbios) para producir productos químicos, generalmente para aplicaciones médicas o industriales.

usar tecnología genética para alterar las características de los organismos (generalmente animales de granja o cultivos)

usar tecnología genética en humanos para tratar una enfermedad

Productos genéticos [volver arriba]

El tipo de ingeniería genética más importante y de mayor éxito es la producción de productos genéticos. Estos productos tienen valor médico, agrícola o comercial. Esta tabla muestra algunos de los ejemplos de productos modificados genéticamente que ya están disponibles.

hormona humana utilizada para tratar la diabetes

hormona del crecimiento humano, utilizada para tratar el enanismo

hormona del crecimiento bovino, utilizada para aumentar la producción de leche de las vacas

factor de coagulación de la sangre humana, utilizado para tratar hemofílicos

agente anticoagulante utilizado en cirugía

antibiótico, utilizado para matar bacterias

antígeno de la hepatitis B, para vacunación

enzima utilizada para tratar la fibrosis quística y el enfisema

enzima utilizada para tratar la enfermedad de Pompe

enzima utilizada en la fabricación de queso

enzima utilizada en la producción de papel

Los productos son en su mayoría proteínas, que se producen directamente cuando se expresa un gen, pero también pueden ser productos no proteicos producidos por enzimas modificadas genéticamente. La idea básica es transferir un gen (a menudo humano) a otro organismo huésped (generalmente un microbio) para que produzca el producto génico de forma rápida, económica y ética. También es posible producir `` proteínas de diseño '' mediante la alteración de las secuencias de genes, pero si bien se trata de una herramienta de investigación útil, todavía no existen aplicaciones comerciales.

Dado que el producto final es solo una sustancia química, en principio se podría utilizar cualquier tipo de organismo para producirlo. Con mucho, el grupo más común de organismos hospedadores que se utilizan para fabricar productos genéticos son las bacterias, ya que se pueden cultivar rápidamente y el producto se puede purificar a partir de sus células. Desafortunadamente, las bacterias no siempre pueden producir proteínas humanas, y recientemente también se han utilizado animales e incluso plantas para fabricar productos genéticos. En ningún caso es conveniente extraer el producto de sus células, por lo que en los animales el producto debe secretarse en la leche u orina, mientras que en las plantas el producto debe secretarse desde las raíces. Esta tabla muestra algunas de las ventajas y desventajas de utilizar diferentes organismos para la producción de productos genéticos modificados genéticamente.

No hay núcleo, por lo que el ADN es fácil de modificar, tienen plásmidos, genomas pequeños, bien entendidos, asexuales, por lo que se pueden clonar pequeños y de rápido crecimiento, fáciles de cultivar comercialmente en fermentadores, se utilizarán carbohidratos baratos con pocos problemas éticos.

No se pueden empalmar intrones sin modificación postraduccional tamaño pequeño del gen

Pueden empalmar intrones pueden hacer modificaciones postraduccionales pueden aceptar genes grandes

No tienen plásmidos (excepto levaduras) a menudo diploides, por lo que es posible que sea necesario insertar dos copias de genes. El control de la expresión no se comprende bien.

Asexual, por lo que se puede clonar haploide, por lo que solo se necesita una copia se puede cultivar en cubas

No siempre se pueden fabricar productos genéticos de animales

Fotosintético, por lo que no necesita mucha alimentación, se puede clonar a partir de células individuales, los productos se pueden secretar de las raíces o en la savia.

Las paredes celulares difíciles de penetrar por vectores de crecimiento lento deben cultivarse en campos multicelulares

Los productos con mayor probabilidad de producir proteínas humanas pueden secretarse en la leche o la orina.

Multicelular de crecimiento lento

Veremos algunos ejemplos en detalle.

Insulina humana [volver arriba]

La insulina es una pequeña hormona proteica producida por el páncreas para regular la concentración de azúcar en sangre. En la enfermedad diabetes insulinodependiente las células del páncreas no producen suficiente insulina, lo que provoca síntomas de desgaste y, finalmente, la muerte. La enfermedad se puede tratar con éxito mediante la inyección de insulina extraída del páncreas de vacas y cerdos sacrificados. Sin embargo, la insulina de estas especies tiene una secuencia de aminoácidos ligeramente diferente a la de la insulina humana y esto puede provocar rechazo inmunológico y efectos secundarios.

El gen de la insulina humana fue aislado, clonado y secuenciado en la década de 1970, por lo que fue posible insertar este gen en bacterias, que luego podrían producir insulina humana en grandes cantidades. Desafortunadamente, no fue tan simple. En los seres humanos, las células pancreáticas primero producen pro-insulina, que luego se somete a una modificación postraduccional para producir la insulina funcional final. Las células bacterianas no pueden realizar modificaciones postraduccionales. Finalmente, se elaboró ​​un gen de ADNc sintético y se insertó en la bacteria. E. coli, que produjo proinsulina, y la conversión postraduccional a insulina se llevó a cabo químicamente. Esta técnica fue desarrollada por Eli Lilly and Company en 1982 y el producto, humulin , se convirtió en el primer producto de ingeniería genética aprobado para uso médico.

En la década de 1990 se mejoró el procedimiento mediante el uso de la levadura Saccharomyces cerevisiae en lugar de E. coli. La levadura, como eucariota, es capaz de modificación postraduccional, por lo que esto simplifica la producción de insulina humana. Sin embargo, otra empresa ha desarrollado un método para convertir la insulina de cerdo en insulina humana cambiando químicamente algunos aminoácidos, y esto resulta ser más barato que los métodos de ingeniería genética. Todo esto demuestra que los ingenieros genéticos todavía tienen mucho que aprender.

Hormona de crecimiento humano (HGH) [volver arriba]

La HGH es una hormona proteica secretada por la glándula pituitaria, que estimula el crecimiento de los tejidos. La baja producción de HGH en la infancia da como resultado enanismo hipofisario. Esto se puede tratar con HGH extraída de humanos muertos, pero como el tratamiento causó algunos efectos secundarios, como la enfermedad de Creutzfeldt-Jacod (CJD), se retiró el tratamiento. Se clonó el gen HGH y se insertó un gen de ADNc artificial en E. coli. Se ha agregado una secuencia señal que no solo hace que el gen se traduzca, sino que también hace que la proteína sea secretada por la célula, lo que hace que la purificación sea mucho más fácil. Genentech produce esta HGH modificada genéticamente y puede restaurar con éxito la estatura normal a los niños con deficiencia de HGH.

Somatotropina bovina (BST) [volver arriba]

Esta es una hormona del crecimiento producida por el ganado. El gen ha sido clonado en bacterias por la empresa Monsanto, que puede producir grandes cantidades de BST. En los EE. UU., el ganado a menudo se inyecta con BST cada 2 semanas, lo que da como resultado un aumento del 10% en la masa del ganado de carne y un aumento del 25% en la producción de leche en las vacas lecheras. BST se probó en el Reino Unido en 1985, pero no fue aprobado y su uso está prohibido actualmente en la UE. Esto se debe en parte a las preocupaciones del público y en parte a que ya existe una sobreproducción de leche y carne de vacuno en la UE, por lo que no es necesaria una mayor producción.

Rennin [volver arriba]

La renina es una enzima utilizada en la producción de queso. Se produce en el estómago de los mamíferos jóvenes (incluidos los humanos) y ayuda a la digestión de la proteína de la leche, la cesina, solidificándola para que permanezca más tiempo en el estómago. Tradicionalmente, la industria del queso ha utilizado la renina obtenida del estómago de terneros jóvenes cuando son sacrificados para la carne de ternera, pero existen objeciones morales y prácticas a esta fuente. Ahora se ha elaborado un gen de ADNc artificial para la renina a partir de ARNm extraído de las células del estómago de ternera, y este gen se ha insertado en una variedad de microbios, como la bacteria. E. coli y el hongo Aspergillus niger. La renina extraída de estos microbios ha tenido mucho éxito y el 90% de todos los quesos duros del Reino Unido se elaboran con renina microbiana. A veces (aunque no siempre) estos productos se etiquetan como `` queso vegetariano ''.

AAT (una -1-antitripsina) [volver arriba]

AAT es una proteína humana producida en el hígado y que se encuentra en la sangre. Como su nombre indica, es un inhibidor de las enzimas proteasas como la tripsina y la elastasa. Existe una mutación rara del gen AAT (una sustitución de una sola base) que hace que AAT esté inactiva y, por lo tanto, las enzimas proteasas se desinhiban. El efecto más notable de esto en los pulmones, donde elastasa digiere el tejido elástico de los alvéolos, lo que conduce a la enfermedad pulmonar enfisema. Esta condición se puede tratar inhalando un aerosol que contenga AAT para que llegue a los alvéolos e inhiba la elastasa allí.

La AAT para este tratamiento se puede extraer de las donaciones de sangre, pero solo en cantidades muy pequeñas. Se ha encontrado y clonado el gen de la AAT, pero la AAT no se puede producir en bacterias porque la AAT es glicoproteína, lo que significa que necesita que se le agreguen azúcares mediante una modificación postraduccional. Este tipo de modificación solo puede ser realizado por animales, y la AAT ahora es producida por ovejas modificadas genéticamente. Para facilitar la extracción de la AAT, el gen se acopló a un promotor de la proteína de la leche b -lactoglubulina. Dado que este promotor solo se activa en las células de la glándula mamaria, el gen AAT solo se expresará en las células de la glándula mamaria y, por lo tanto, se secretará en la leche de oveja. Esto hace que sea muy fácil de cosechar y purificar sin dañar a las ovejas. La primera oveja transgénica en producir AAT se llamó Tracy, y fue producida por PPL Pharmaceuticals en Edimburgo en 1993. Así es como Tracy s hecho:

A una oveja se le administra un medicamento para la fertilidad para estimular la producción de óvulos y se extraen varios óvulos maduros de sus ovarios.

Los huevos son fertilizados in vitro.

Se prepara un plásmido ed que contiene el gen de la AAT humana y la secuencia promotora de la b-lactoglobulina. Cientos de copias de este plásmido se microinyectan en el núcleo de los cigotos fertilizados. Solo algunos de los cigotos se transformarán, pero en esta etapa no se puede decir cuál.

Los cigotos se dividen in vitro hasta que los embriones estén en la etapa de 16 células.

Los embriones de 16 células se implantan en el útero de ovejas madres sustitutas. Solo unas pocas implantaciones dan como resultado un embarazo exitoso.

Analizar a toda la descendencia de las madres sustitutas para determinar la producción de AAT en su leche. Esta es la única forma de averiguar si el cigoto tomó el gen AAT para que pueda expresarse. Aproximadamente 1 de cada 20 huevos tiene éxito.

Recolecta leche de las ovejas transgénicas por el resto de sus vidas. Su leche contiene alrededor de 35 g de AAT por litro de leche. También críe a partir de ellos para formar un rebaño de ovejas transgénicas.

Purifique el AAT, que tiene un valor aproximado de 50 000 libras esterlinas por mg.

Nuevos fenotipos [volver arriba]

Esto significa alterar las características de los organismos mediante ingeniería genética. Los organismos son generalmente cultivos o animales de granja de importancia comercial y el objetivo es mejorar su calidad de alguna manera. Esto puede verse como una versión de alta tecnología de crianza selectiva, que ha sido utilizado por los seres humanos para modificar y mejorar sus cultivos y animales durante al menos 10 000 años. Sin embargo, los transgénicos han resultado ser un desarrollo muy controvertido. No necesitamos estudiar ninguno de estos en detalle, pero esta tabla da una idea de lo que se está haciendo.

El gen de la proteína de la cubierta del virus se ha clonado e insertado en plantas de tabaco, patata y tomate. La proteína de la cubierta parece `` inmunizar '' a las plantas, que son mucho más resistentes al ataque viral.

Cultivos resistentes a herbicidas

Microbios de limpieza del medio ambiente

Terapia de genes [volver arriba]

Este es quizás el tipo de ingeniería genética más importante y controvertida. También es el menos desarrollado. La idea de la terapia génica es alterar genéticamente a los humanos para tratar una enfermedad. Esta podría representar la primera oportunidad para curar enfermedades incurables. Tenga en cuenta que esto es bastante diferente al uso de microbios diseñados genéticamente para producir un medicamento, vacuna u hormona para tratar una enfermedad por medios convencionales. La terapia genética significa alterar el genotipo de un tejido o incluso de un ser humano completo.

Fibrosis quística [volver arriba]

La fibrosis quística (FQ) es la enfermedad genética más común en el Reino Unido, que afecta aproximadamente a 1 de cada 2500. Es causada por una mutación en el gen de la proteína llamada CFTR (regulador transmembrana de fibrosis quística). El gen se encuentra en el cromosoma 7, y en realidad se conocen más de 300 mutaciones diferentes, aunque la mutación más común es una deleción de tres bases, eliminando un aminoácido de los 1480 aminoácidos de la proteína. CFTR es una proteína del canal de iones cloruro que se encuentra en la membrana celular de las células del tejido epitelial (revestimiento) y la mutación detiene el funcionamiento de la proteína, por lo que los iones cloruro no pueden atravesar la membrana celular.

Los iones de cloruro se acumulan dentro de estas células, lo que hace que los iones de sodio entren para equilibrar la carga, y el aumento de la concentración de ambos iones dentro de las células epiteliales disminuye el potencial osmótico. Por lo tanto, el agua se retiene dentro de las células, lo que significa que el moco secretado por estas células es más seco y pegajoso de lo normal. Este moco pegajoso bloquea los conductos por los que se secreta, como el intestino delgado, el conducto pancreático, el conducto biliar, el conducto de los espermatozoides, los bronquiolos y los alvéolos.

Estos bloqueos conducen a los síntomas de la FQ: disnea, infecciones pulmonares como bronquitis y neumonía, mala digestión y absorción e infertilidad. De estos síntomas, los efectos pulmonares son los más graves y causan el 95% de las muertes. La FQ siempre es fatal, aunque la esperanza de vida ha aumentado de 1 año a aproximadamente 20 años debido a los tratamientos modernos. Estos tratamientos incluyen fisioterapia muchas veces al día para eliminar la mucosidad de los pulmones, antibióticos para combatir infecciones, medicamentos con ADNasa para aflojar la mucosidad, enzimas para ayudar a la digestión de los alimentos e incluso un trasplante de corazón-pulmón.

Dados estos tratamientos complicados (y finalmente infructuosos), la FQ es un buen candidato para la terapia génica y fue una de las primeras enfermedades que se abordó de esta manera. El gen de CFTR se identificó en 1989 y poco después se hizo un clon de ADNc. La idea es enviar copias de este buen gen a las células epiteliales del pulmón, donde pueden incorporarse al ADN nuclear y crear canales de cloruro CFTR funcionales. Si se pudiera corregir aproximadamente el 10% de las células, se curaría la enfermedad.

Se están probando dos métodos de administración: liposomas y adenovirus, ambos administrados con un inhalador de aerosol, como los que usan los asmáticos. Actualmente se están realizando ensayos clínicos, pero hasta ahora no se ha demostrado que ninguna terapia tenga éxito.

SCID [volver arriba]

La enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave (SCID) es una enfermedad genética rara que afecta el sistema inmunológico. Es causada por una mutación en el gen de la enzima. adenosina desaminasa (ADA). Sin esta enzima, los glóbulos blancos no se pueden producir, por lo que los pacientes casi no tienen un sistema inmunológico eficaz y contraerían rápidamente una infección mortal a menos que pasen la vida en aislamiento estéril (la SCID también se conoce como `` síndrome del bebé en una burbuja ''). Se ha intentado la terapia génica con algunos niños en los EE. UU. Y el Reino Unido mediante la extracción quirúrgica de células de la médula ósea (que fabrican glóbulos blancos en el cuerpo) del paciente, transfectándolas con un virus modificado genéticamente que contiene el gen ADA y luego regresando las células transformadas al paciente. La esperanza es que estas células transformadas se multipliquen en la médula ósea y produzcan glóbulos blancos. Las pruebas aún están en curso, por lo que se desconoce el éxito.

El futuro de la terapia genética [volver arriba]

La terapia génica está en su infancia y todavía es un área de investigación más que de aplicación. Nadie se ha curado todavía con la terapia génica, pero el potencial sigue siendo atractivo. La terapia génica no tiene por qué limitarse siquiera al tratamiento de enfermedades genéticas, sino que también podría ayudar en el tratamiento de infecciones y enfermedades ambientales:

La terapia de la línea germinal sería muy eficaz, pero también potencialmente peligrosa (ya que se desconocen los efectos a largo plazo de las alteraciones genéticas), poco ética (ya que podría conducir fácilmente a la eugenesia) e inmoral (ya que podría implicar la alteración y destrucción de seres humanos). embriones). Actualmente es ilegal en el Reino Unido y la mayoría de los demás países, y la investigación actual se centra únicamente en la terapia de células somáticas. Todos los ensayos de terapia génica en el Reino Unido deben ser aprobados por el Comité Asesor de Terapia Génica (GTAC), un organismo gubernamental que revisa los fundamentos médicos y éticos de un ensayo. La modificación de la línea germinal está permitida en los animales y, de hecho, es la base para producir OMG.


TECNOLOGÍAS EMERGENTES DE INGENIERÍA GENÉTICA

Además de las tecnologías discutidas anteriormente, se han desarrollado nuevos enfoques de ingeniería genética y se están refinando y mejorando. Aunque aún no se han aplicado a productos comerciales, tienen un valor práctico para futuros cultivos transgénicos. Las tecnologías incluyen la edición del genoma, componentes de ADN sintético y cromosomas artificiales, y modificaciones epigenéticas dirigidas.

Edición del genoma

La edición del genoma utiliza nucleasas dirigidas al sitio (SSN de nucleasas específicas de secuencia) para mutar secuencias de ADN específicas en un organismo. Al usar los sistemas SSN, los científicos pueden eliminar, agregar o cambiar bases específicas en un locus designado. Los SSN escinden el ADN en sitios específicos y dejan una sola rotura (conocida como muesca) o una rotura de doble hebra. La rotura del ADN se puede reparar de dos formas (Figura 7-1):

  • A través del proceso de unión de extremos no homólogos nativos de la célula & rsquos (NHEJ), que conduce a una mutación en el sitio.
  • Si se proporciona una molécula de ADN donante al mismo tiempo que el ADN está siendo editado por las nucleasas, a través de la propia maquinaria de reparación del ADN nativo de la célula, conocida como reparación dirigida por homología (HDR), que incorpora la molécula donante en el sitio de escisión.

Se utilizan cuatro clases principales de SSN en la edición del genoma vegetal (revisado en Voytas y Gao, 2014): meganucleasas, nucleasas de dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN) y las repeticiones palindrómicas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) / Sistema de nucleasa Cas9 (Figura 7-2).El campo de las tecnologías y aplicaciones de edición del genoma ha crecido, especialmente desde el advenimiento del sistema CRISPR / Cas9, y el comité espera descubrimientos adicionales para facilitar la edición del genoma en la próxima década.

Las meganucleasas ocurren naturalmente en bacterias, arqueas y eucariotas y fueron los primeros SSN examinados para la edición del genoma. Las meganucleasas son proteínas simples que reconocen una secuencia en el ADN que tiene al menos 12 nucleótidos de largo y escinden el ADN diana, dejando una ruptura de doble hebra que puede repararse mediante NHEJ o HDR mediante el uso de una molécula donante (revisado en Silva et al. , 2011). Se ha demostrado la edición del genoma mediada por meganucleasa en maíz (Zea mays) y tabaco (Nicotiana spp.) (revisado en Baltes y Voytas, 2014). Es difícil cambiar la especificidad de la secuencia diana de las meganucleasas, por lo que no se utilizan ampliamente para la edición del genoma.

Las proteínas que contienen el dedo de zinc y el dominio ndash se unen al ADN y son de naturaleza generalizada, a menudo funcionan como factores de transcripción (proteínas que regulan la expresión génica uniéndose directa o indirectamente a secuencias de ADN reguladoras que generalmente se encuentran en las regiones promotoras de los genes 3). Los dominios con dedos de zinc se pueden manipular para unir secuencias específicas de ADN cuando se fusionan con el dominio de nucleasa de corte de ADN de la proteína FokI, una ZFN es la molécula híbrida resultante. Un par de funciones ZFN en tándem

3 En el Capítulo 8 se dan ejemplos de ingeniería genética que utiliza factores de transcripción.

FIGURA 7-1 Consecuencias de la escisión del ADN mediante tecnologías de edición del genoma en la célula.
FUENTE: Sander y Joung (2014).
NOTA: Después de la división del ADN de doble hebra por nucleasas específicas de secuencia como meganucleasas, dedos de zinc, efectores de tipo activador de la transcripción y repeticiones palindrómicas agrupadas regularmente interespaciadas / Cas9 (representado por el rayo), la ruptura de la doble hebra en el La molécula de ADN se puede reparar a través de mecanismos de unión de extremos no homólogos nativos (NHEJ) de la célula, lo que conduce a una secuencia de ADN alterada con una deleción (línea roja punteada) o una inserción (línea verde continua). Si se proporciona una plantilla de ADN del donante (ver fragmento de ADN azul), los mecanismos de reparación dirigida por homología (HDR) dentro de la célula insertarán la molécula donante en el locus, y esto conducirá a un gen o región diana editada (región azul con un inserción o modificación precisa).

para cortar el ADN en el sitio objetivo deseado (revisado en Urnov et al., 2010). Al igual que con las meganucleasas, las ZFN se utilizan para introducir mutaciones a través de NHEJ y HDR. Los ZFN se han utilizado en la ingeniería de numerosas especies de plantas (revisado en Baltes y Voytas, 2014). Las ZFN fueron la primera herramienta de edición del genoma de diseño ampliamente utilizada en biología.

Se descubrieron efectores similares a activadores de la transcripción (TALE) en el patógeno vegetal bacteriano Xanthomonas y podría diseñarse para unirse a prácticamente cualquier secuencia de ADN. Su facilidad de diseño para secuencias de ADN diana específicas revolucionó la edición del genoma. En naturaleza, Xanthomonas las especies secretan TALE en las células vegetales para permitir la patogenicidad. Los TALE se unen a los promotores de los genes de las plantas para suprimir la resistencia de las plantas y los rsquos al patógeno. Las bacterias codifican los TALE a través de un código simple o cifrado que ha sido

FIGURA 7-2 Tecnologías de edición del genoma: meganucleasas, nucleasas de dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN) y repeticiones palindrómicas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) / Cas.
FUENTE: Baltes y Voytas (2014).

explotados para diseñar proteínas con especificidad de sitio personalizado en cualquier genoma objetivo (Boch et al., 2009 Moscou y Bogdanove, 2009). Al igual que las ZFN, las TALE pueden fusionarse con el dominio nucleasa de FokI y luego se denominan TALEN. Los TALEN se utilizan en pares, como los ZFN, para afectar las mutaciones dirigidas. Los TALEN se han utilizado para editar genomas en varias plantas, incluido el arroz (Oryza spp.), maíz, trigo (Triticum spp.) y soja (Glycine max) (revisado en Baltes y Voytas, 2014).

CRISPR fue la herramienta de edición del genoma desarrollada más recientemente cuando se estaba redactando el informe del comité y rsquos. Las bacterias albergan CRISPR como un mecanismo de defensa innato contra virus y plásmidos que utiliza nucleasas guiadas por ARN para apuntar a la escisión de secuencias de ADN extrañas. En el momento en que se estaba redactando el informe del comité y rsquos, el sistema CRISPR / Cas utilizado en la edición del genoma era principalmente el tipo II CRISPR / Cas9, de Streptococcus pyogenes, en el que se incorporan secuencias de ADN extraño entre secuencias repetidas en el locus CRISPR y luego se transcriben en una molécula de ARN conocida como crRNA (revisado por Sander y Joung, 2014). El crRNA luego se hibrida con un segundo RNA, el tracrRNA, y el complejo se une a la nucleasa Cas9. El crRNA guía el complejo al ADN diana y, en el caso de inmunidad innata en bacterias, se une a la secuencia complementaria en el ADN diana que luego es escindido por la nucleasa Cas9. Los científicos han diseccionado el sistema CRISPR / Cas9 innato y lo han rediseñado de tal manera que se necesita un solo ARN, el ARN guía, para la escisión mediada por Cas9 de una secuencia diana en un genoma. Los requisitos de diseño del ARN guía se limitan a una secuencia única de aproximadamente 20 nucleótidos en el genoma (para evitar efectos fuera del objetivo) y están restringidos cerca de la secuencia de motivo adyacente al protoespaciador, que es específica para el sistema CRISPR / Cas. Entre las aplicaciones más recientes de CRISPR se incluye el uso de dos ARN guía únicos con una nucleasa modificada que `` iguala '' una hebra del ADN, lo que proporciona una mayor especificidad para las deleciones dirigidas. La facilidad de diseño, la especificidad del ARN guía y la simplicidad del sistema CRISPR / Cas9 han dado como resultado una rápida demostración de la utilidad de este método de edición de genomas en plantas y otros organismos (revisado en Baltes y Voytas, 2014). La edición del genoma, especialmente CRISPR, está cambiando rápidamente. En el momento en que se estaba redactando el informe del comité y rsquos, se habían descrito recientemente endonucleasas no Cas9 (por ejemplo, Cpf1) para la edición del genoma CRISPR (Zetsche et al., 2015).

Cuando el comité estaba escribiendo su informe, las aplicaciones de SSN en la edición del genoma se habían utilizado principalmente para introducir mutaciones en el locus objetivo a través de NHEJ para producir knockouts de genes. Como se muestra en la Figura 7-1, las nucleasas también se pueden usar para el reemplazo de secuencias a través de HDR (o potencialmente NHEJ) si el ADN de un donante se co-introduce en la célula. Pueden usarse múltiples tipos de moléculas donantes. Primero, se puede introducir un alelo alternativo del locus diana de tal manera que el gen modificado codifique una proteína que confiera un rasgo nuevo o mejorado. Por ejemplo, la modificación de un único nucleótido específico en el gen de la acetolactato sintasa (ALS) puede conferir resistencia a herbicidas que utilizan la inhibición de ALS como su modo de acción (Jander et al., 2003). En segundo lugar, se puede usar la recombinación homóloga para introducir una secuencia nueva en ese locus. Esta "inserción del genoma de precisión" mediante la ingeniería de un sitio de aterrizaje eliminaría la inserción semialeatoria de transgenes en Agrobacterium-métodos de transformación mediada por pistola genética y mediada por pistola genética. También permitiría la combinación de modificados o

genes editados en un solo locus, denominado & ldquotrait landing pads, & rdquo en el genoma en lugar de aleatoriamente en el genoma, por lo que sería más fácil agregar nuevos rasgos a un cultivo transgénico que estén físicamente vinculados en el genoma (Ainley et al., 2013 ). Esta estrategia también permitiría la eliminación de genes insertados cuando se desee.

La edición del genoma a través de CRISPR y otras técnicas podría realizarse en plantas mediante la expresión transitoria de transgenes (Clasen et al., 2016) o sin ADN exógeno en absoluto (Woo et al., 2015), lo que da como resultado plantas transgénicas que carecen del transgén. Clasen y col. (2016) utilizaron un par TALEN codificado genéticamente para producir mutaciones específicas en protoplastos de papa. Las plantas de papa recuperadas de los protoplastos con alelos dirigidos mutados contenían un nuevo rasgo de calidad, y siete de las 18 líneas GE no contenían ninguna construcción transgénica de TALEN en el genoma de la papa. Woo y col. (2015) utilizaron proteína Cas9 traducida in vitro y ndash acoplada para guiar el ARN para mutar genes en Arabidopsis, protoplastos de tabaco, lechuga y arroz, de los cuales se recuperaron plantas mutadas. Por tanto, parece que la edición del genoma se puede realizar en cultivos sin dejar ninguna huella de ADN transgénico en el genoma. En ausencia de mutaciones fuera del objetivo, lo cual es evidente a partir de la secuenciación dirigida profunda en el experimento de la papa (Woo et al., 2015), los reactivos de edición del genoma 4 que no dejan un transgén en el genoma parecerían ser valiosos. enfoque de mejoramiento de cultivos.

Los ejemplos anteriores se centran en el uso de SSN para escindir el ADN e introducir cambios permanentes en la secuencia del ADN de doble hebra a través de NHEJ o HDR. Sin embargo, existen otras aplicaciones mediante las cuales las proteínas que se unen al ADN de una manera específica de secuencia pueden explotarse para modificar genes y actividad genética. Incluyen la fusión de las características de unión al ADN de las proteínas con dedos de zinc (ZFP) o TALE para activar dominios para producir activadores transcripcionales sintéticos. Sin fusiones de activadores, las ZFP o TALE pueden usarse como represores de la transcripción. Las características de diseño de ZFP y TALE permiten la producción de factores de transcripción sintéticos (TF) para regular la expresión de prácticamente cualquier gen diana (Figura 7-3). De hecho, los TALE-TF se han utilizado en conjunto para producir activación genética aditiva en plantas transgénicas (Liu et al., 2014). Para el sistema CRISPR / Cas9, se puede fusionar un conjunto de moléculas con una nucleasa Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) para permitir una amplia gama de modificaciones de la regulación génica, conocidas colectivamente como interferencia CRISPR (revisado en Doudna y Charpentier, 2014 Figura 7- 3). Quizás la aplicación más simple es la fusión de dCas9 a un activador transcripcional o un represor transcripcional cuando se introduce en una célula con un ARN guía, el activador transcripcional o represor puede modificar el número de transcripciones

4 Las nucleasas que se han personalizado para dirigirse a una secuencia específica se denominan reactivos.

del gen diana de forma similar a las ZFP y TALE. Los genes dCas9 podrían potencialmente fusionarse con genes de modificación de la cromatina y guiarse a una región objetivo por el ARN guía para modificar el estado epigenético de un locus y, por lo tanto, afectar la transcripción (Doudna y Charpentier, 2014).

RESULTADO: La explotación de los procesos biológicos inherentes y las proteínas de dedo de zinc que se unen al mdashDNA (ZFN), la transcripción de genes del huésped dirigida por patógenos (TALE) y la degradación dirigida de las secuencias de ADN (CRISPR / Cas) y mdashnow permiten una manipulación precisa y versátil del ADN en las plantas.

Cromosomas artificiales y sintéticos

Un mayor conocimiento de los procesos biológicos y las herramientas avanzadas de biología molecular no solo facilitará la ingeniería de múltiples genes en las plantas, sino que también hará posible la inserción de vías o procesos bioquímicos completos y novedosos. Las construcciones de ADN utilizadas en la ingeniería genética vegetal han sido pequeñas (menos de 20 y 40 kilobases) y han utilizado técnicas tradicionales de clonación molecular que son lentas y laboriosas. Sin embargo, se han desarrollado métodos nuevos y económicos para sintetizar moléculas de ADN y ensamblarlas en moléculas de ADN más grandes. Los métodos permiten la construcción rápida y fácil de rutas multigénicas en una sola molécula de ADN (para una revisión, véase Ellis et al., 2011). La viabilidad de las técnicas se ha demostrado mediante la síntesis de un genoma bacteriano completo (Gibson et al., 2010) y la creación de un cromosoma de levadura sintético (Annaluru et al., 2014). A los investigadores les gustaría poder introducir decenas a cientos de genes en plantas. Un método previsto para lograr tales avances sería el uso de minicromosomas artificiales o cromosomas sintéticos. Un minicromosoma artificial es un cromosoma añadido a la planta y rsquos compuesto natural de cromosomas en el núcleo. Un cromosoma sintético (Annaluru et al., 2014) es una síntesis total de ADN para reemplazar un cromosoma natural o incluso un genoma de orgánulos completo, como el genoma del plastoma.

Los cromosomas y genomas artificiales o sintéticos permitirían el ensamblaje de una gran cantidad de genes en una molécula autorreplicante. En eucariotas, los cromosomas son moléculas de ADN lineales con las secuencias adecuadas para la replicación (orígenes de replicación), integridad (telómeros) y segregación en células en división (centrómeros). El uso de cromosomas artificiales o sintéticos permitiría la introducción de genes en plantas de una manera que no tiene el potencial de alterar genes en cromosomas de plantas nativas en los sitios de inserción.

No se han creado cromosomas o genomas sintéticos en plantas, pero los métodos utilizados para hacer un cromosoma sintético de levadura (Annaluru et

FIGURA 7-3 Usos alternativos de las tecnologías de edición del genoma.
FUENTE: Ilustración proporcionada por C. R. Buell.
NOTA: A, Un dedo de zinc o un efector similar a un activador de la transcripción (TALE) (azul) se puede fusionar con un activador de la transcripción (verde) para aumentar la transcripción de un gen de interés. B, Un dedo de zinc o TALE (azul) se puede fusionar con un represor transcripcional (rojo) para suprimir la transcripción de un gen de interés. C, Una nucleasa Cas9 catalíticamente inactiva (violeta) puede fusionarse con un activador transcripcional (verde) y, en presencia de un ARN guía (naranja y amarillo), guiar el complejo al promotor de un gen de interés y aumentar la transcripción de el gen diana. D, A catalíticamente

FIGURA 7-3 Continuado

La nucleasa Cas9 inactiva (violeta) se puede fusionar con un represor transcripcional (rojo) y, en presencia de un ARN guía (naranja y amarillo), guiar el complejo al promotor de un gen de interés y disminuir la transcripción del gen diana. E, Una nucleasa Cas9 catalíticamente inactiva (violeta) puede fusionarse con una enzima de metilación del ADN y, en presencia de un ARN guía (naranja y amarillo), guiar el complejo al promotor de un gen de interés, dirigiéndose a ese gen para metilación y, como consecuencia, suprimiendo la transcripción.

al., 2014) deberían ser transferibles a las plantas. El cromosoma III de levadura, que tiene 316,617 bases, fue reemplazado por un cromosoma sintetizado en laboratorio de 272,871 bases. El genoma del cloroplasto, que tiene entre la mitad y un tercio del tamaño del cromosoma III de levadura, podría previsiblemente sintetizarse e insertarse en una planta, como el tabaco, que ya es susceptible de transformación de plastoma. El costo de la síntesis de ADN continúa disminuyendo, por lo que el desarrollo experimental en este campo sería económicamente viable.

La investigación sobre minicromosomas artificiales para plantas generalmente ha adoptado dos enfoques (revisado en Gaeta et al., 2012 Birchler, 2015). En el enfoque & ldquobottom-up & rdquo, las partes clave de un cromosoma & mdash, como el centrómero, el telómero, el origen de replicación y los genes de interés & mdash, se ensamblan, y esto da como resultado un minicromosoma de novo. Aunque se ha avanzado con este enfoque, características adicionales, como la modificación epigenética de los nucleótidos del ADN, pueden afectar la expresión génica (ver más abajo) y la capacidad del minicromosoma para replicarse en una célula y han impedido que el enfoque se use de forma rutinaria. El enfoque & ldquotop-down & rdquo utiliza esencialmente los cromosomas existentes y mdash que se aproxima al enfoque del cromosoma de levadura sintética y mdash para construir un cromosoma artificial con una plantilla existente. Este enfoque ha dado como resultado la transmisión del minicromosoma a través de la meiosis, pero no tan eficientemente como la de los cromosomas nativos. Ninguno de los enfoques ha dado como resultado minicromosomas prácticamente desplegables. Por lo tanto, el uso de un enfoque sintético para reemplazar el ADN sistemáticamente, análogo al enfoque del proyecto de levadura, podría ser posible en el futuro (Birchler, 2015). También es posible que los enfoques ascendentes o descendentes actuales funcionen en cultivos de propagación clonal, como la papa, dado que no se requiere la meiosis (Birchler, 2015).

Con una sólida base de conocimientos de genes que subyacen a la bioquímica vegetal, se pueden sintetizar construcciones precisas in vitro e introducirse en una especie heteróloga a través de Agrobacterium-transformación mediada o mediada por pistola genética o inserción dirigida por nucleasa en un único sitio seleccionado. Por ejemplo, ajenjo dulce (Artemisia annua) produce artemisinina, un compuesto antipalúdico. Con cinco genes de levadura y de A. annua, el tabaco fue diseñado para sintetizar artemisinina (Farhi et al., 2011). Aunque el rendimiento de artemisinina en el tabaco fue menor que en A. annua, este estudio de prueba de concepto demostró la viabilidad de la ingeniería de rutas biosintéticas heterólogas en plantas. Con un mayor refinamiento de los promotores, una mejor comprensión de la compartimentación y transporte de metabolitos y el flujo en células y tejidos, y el desarrollo de vectores tales como cromosomas artificiales capaces de transferir grandes segmentos de ADN a células vegetales, ingeniería genética de plantas para rasgos complejos, como heterólogos o nuevas vías bioquímicas, y para fisiológicas especializadas

y los procesos de desarrollo, como la fotosíntesis de C4, pueden ser posibles (ver el Capítulo 8 para más detalles).

Modificaciones epigenéticas dirigidas

Como se describió anteriormente en este capítulo, los cambios hereditarios y relativamente estables en la expresión de genes específicos pueden ser el resultado de cambios en el epigenoma. Los cambios en la metilación del ADN en particular tienen más probabilidades de resultar en cambios hereditarios en la expresión génica en las plantas. A medida que aumenta la comprensión de la bioquímica de los sistemas que cambian los patrones de metilación del ADN, también aumenta la capacidad de apuntar a genes específicos para modificaciones epigenéticas. Tal dirección implicaría expresar las proteínas y quizás también ácidos nucleicos específicos (por ejemplo, un ARN guía) que dirigiría la metilación del ADN a un locus específico. El sistema de focalización podría eliminarse después de que se haya realizado la modificación epigenética, por ejemplo, mediante el uso de fitomejoramiento convencional para segregar el sistema de focalización.

Sobre el tema clave de la seguridad, cambiar las modificaciones epigenéticas de genes de plantas particulares no presenta problemas fundamentales; los genomas de las plantas están repletos de modificaciones epigenéticas y el ADN modificado epigenéticamente ha estado en el medio ambiente y ha sido consumido por los seres humanos durante miles de años. Por tanto, la cuestión de la seguridad es la misma que implica cualquier técnica, ya sea de ingeniería genética o no genética, que se traduce en un aumento o disminución de la expresión de genes específicos en una planta y en alteraciones de rasgos específicos.

Cabe señalar que, además de los enfoques dirigidos, existen varias formas de alterar de forma amplia y aleatoria el epigenoma de una planta, como la sobreexpresión de una enzima que altera la metilación del ADN. Por supuesto, los enfoques amplios y aleatorios para alterar el genoma de una planta no son nuevos: la mutagénesis es un enfoque amplio y aleatorio para la modificación del genoma. La utilidad de los enfoques amplios y aleatorios de la modificación del genoma o del epigenoma es que si la bioquímica o la genética de un proceso no se comprenden lo suficiente como para permitir un enfoque específico, ya sea un enfoque de ingeniería genética o uno que no sea de ingeniería genética (como el mejoramiento asistido por marcadores) & mdasha El enfoque aleatorio podría producir un resultado deseable.Como se discutió anteriormente, los enfoques amplios y aleatorios darán lugar a cambios más desconocidos que los enfoques dirigidos.

La consistencia suele ser una característica deseable de las nuevas variedades de plantas. Dado que los cambios epigenéticos pueden volver al estado inicial en frecuencias variadas, la modificación epigenética podría no ser un enfoque ideal para producir nuevas variedades de plantas. Sin embargo, si una nueva variedad vegetal derivada de un cambio epigenético es superior a las alternativas estables, la posibilidad de cierto grado de reversión puede no ser un obstáculo para la comercialización.


La senescencia foliar provocada por la edad e inducida por la oscuridad requiere los factores de transcripción bHLH PIF3, 4 y 5

La senescencia de las hojas puede ser provocada y promovida por una gran cantidad de factores ambientales y de desarrollo. Numerosas líneas de evidencia han sugerido una participación de los fitocromos en la regulación de la senescencia de las hojas, pero las vías de señalización relacionadas y los mecanismos fisiológicos son poco conocidos. En este estudio, identificamos inicialmente los factores de interacción con fitocromos (PIF) 3, 4 y 5 como supuestos mediadores de la senescencia foliar. Las mutaciones de los genes PIF resultaron en una longevidad de la hoja significativamente mejorada en la senescencia inducida por la oscuridad y provocada por la edad, mientras que las sobreexpresiones de estos genes aceleraron la senescencia inducida por la oscuridad y provocada por la edad en Arabidopsis. De manera constante, la pérdida de función de PIF4 atenuó los cambios transcripcionales inducidos por la oscuridad asociados con el deterioro del cloroplasto y la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). Los ensayos de ChIP-PCR y Dual-Luciferase demostraron que PIF4 puede activar el gen regulador de la degradación de la clorofila NYE1 y reprimir el gen mantenedor de la actividad del cloroplasto GLK2 al unirse a sus regiones promotoras. Finalmente, la biosíntesis de etileno inducida por la oscuridad y la senescencia inducida por etileno fueron amortiguadas en pif4, lo que sugiere la participación de PIF4 tanto en la biosíntesis de etileno como en la vía de señalización. Nuestro estudio proporciona evidencia de que PIF3, 4 y 5 son nuevos mediadores de senescencia positivos y obtiene una idea del mecanismo de señalización luminosa involucrado en la regulación de la senescencia de la hoja.

Palabras clave: GLK2 NYE1 / SGR1 Deterioro del cloroplasto etileno. factor de interacción con el fitocromo de la senescencia de la hoja (PIF).

© The Author 2014. Publicado por Oxford University Press en nombre de CSPB e IPPE, SIBS, CAS.

Cifras

PIF3, 4 y 5 promueven la senescencia foliar provocada por la edad y la inducida por la oscuridad. (A) Fenotipos de…

Análisis transcriptómico de pif4 Mutante ...

Análisis transcriptómico de pif4 Mutante. (A) Representaciones de diagrama de caja de 791 senescencia regulada al alza y…

PIF4 regula negativamente la actividad del cloroplasto.…

PIF4 regula negativamente la actividad del cloroplasto. (A) Expresiones relativas de NYE1 , GLK1 ,…

PIF4 regula la biosíntesis de etileno ...

PIF4 regula tanto la biosíntesis de etileno como la señalización. (A) Expresiones relativas de ACS2 ,…


Las 4 principales aplicaciones de la ingeniería genética

Los siguientes puntos destacan las cuatro principales aplicaciones de la ingeniería genética. Las aplicaciones son: 1. Aplicación en agricultura 2. Aplicación en medicina 3. Producción de energía 4. Aplicación en industrias.

Ingeniería genética: Aplicación n. ° 1. Aplicación en agricultura:

Una aplicación importante de la tecnología del ADN recombinante es alterar el genotipo de las plantas de cultivo para hacerlas más productivas, nutritivas, ricas en proteínas, resistentes a enfermedades y que consuman menos fertilizantes. La tecnología de ADN recombinante y las técnicas de cultivo de tejidos pueden producir cereales, legumbres y hortalizas de alto rendimiento.

Algunas plantas han sido programadas genéticamente para producir granos ricos en proteínas que podrían mostrar resistencia al calor, la humedad y las enfermedades.

Algunas plantas pueden incluso desarrollar sus propios fertilizantes, algunas han sido transformadas genéticamente para producir sus propios insecticidas. A través de la ingeniería genética se han producido algunas variedades que podrían fijar directamente el nitrógeno atmosférico y, por tanto, no hay dependencia de los fertilizantes.

Los científicos han desarrollado semillas transgénicas de papa, tabaco, algodón, maíz, fresa y colza que son resistentes a las plagas de insectos y ciertos herbicidas.

La bacteria Bacillus thurenginesis produce una proteína que es tóxica para los insectos. Utilizando las técnicas de la ingeniería genética, el gen que codifica esta proteína tóxica llamada gen Bt se ha aislado de una bacteria y se ha manipulado en plantas de tomate y tabaco. Tales plantas transgénicas mostraron necesidad de gusanos cuernos del tabaco y gusanos del fruto del tomate. Estos genotipos están a la espera de su lanzamiento en EE. UU.

Hay ciertos herbicidas evolucionados genéticamente que no son específicos de las malas hierbas solamente, sino que también matan cultivos útiles. El glifosato es un herbicida de uso común que simplemente inhibe una enzima esencial particular en las malezas y otras plantas de cultivo. Un gen diana del glifosato está presente en la bacteria salmonella typhimurium. Un mutante de S. typhimurium es resistente al glifosato.

El gen mutante se clonó en E. coli y luego se volvió a clonar en Agrobacterium tumifaciens a través de su Plásmido Ti. La infección de plantas con plásmido Ti que contiene el gen resistente al glifosato ha producido cultivos como el algodón, el tabaco y el maíz, todos los cuales son resistentes al glifosato.

Esto hace posible rociar los campos de cultivo con glifosato que matará solo las malas hierbas y los cultivos modificados genéticamente con genes resistentes no se verán afectados.

Recientemente, Calogene, una empresa de biotecnología, ha aislado un gen bacteriano que desintoxica los efectos secundarios de los herbicidas. Se han desarrollado plantas de tabaco transgénicas resistentes al virus del mosaico T MV y del tomate i resistentes al virus del mosaico dorado mediante la transferencia de genes de proteínas de la cubierta del virus a plantas susceptibles. Estos aún no se han publicado.

La tecnología de transferencia de genes también puede desempeñar un papel importante en la producción de una variedad nueva y mejorada de árboles maderables.

Se han producido varias especies de microorganismos que pueden degradar productos químicos tóxicos y podrían usarse para matar patógenos dañinos y plagas de insectos.

Para el uso de técnicas de ingeniería genética para la transferencia de genes extraños a las células de la planta huésped, ya se han clonado varios genes y ahora se conocen bibliotecas completas de ADN y ADN mt de guisante.

Algunos de los genes clonados incluyen:

(i) Genes para la faseolina del frijol francés,

(ii) Poca hemoglobina de la pierna de faseolina para la soja,

(iii) Genes para la carboxilasa RUBP de pequeñas subunidades del guisante, y genes i para la proteína de almacenamiento en algunos cereales.

Se están realizando esfuerzos para mejorar varios cultivos agrícolas utilizando diversas técnicas de ingeniería genética que incluyen:

(i) Transferencia de genes fijadores de nitrógeno (genes nif) de leguminosas a cereales.

(ii) Transferencia de resistencia contra patógenos y plagas de plantas silvestres a plantas de cultivo.

(iii) Mejora de la calidad y cantidad de proteínas de semillas.

(iv) Transferencia de genes para proteínas animales a plantas de cultivo.

(v) Eliminación de genes no deseados de susceptibilidad a diferentes enfermedades de líneas citoplásmicas masculinas estériles en cultivos como el maíz, donde la esterilidad masculina citoplasmática y la susceptibilidad se localizan en el plásmido mitocondrial.

(vi) Mejora de la eficiencia fotosintética mediante el reensamblaje de genes nucleares y de cloroplasto y por la posible conversión de C3 plantas en C4 plantas.

(vii) Desarrollo de líneas celulares que pueden producir alimentos nutritivos en biorreactores.

Ingeniería genética: Aplicación n. ° 2. Aplicación a la Medicina:

La ingeniería genética ha ido ganando importancia en los últimos años y será más importante en el siglo actual a medida que las enfermedades genéticas se vuelvan más prevalentes y se reduzca la superficie agrícola. La ingeniería genética juega un papel importante en la producción de medicamentos.

Actualmente se manipulan microorganismos y sustancias vegetales para producir una gran cantidad de medicamentos, vacunas, enzimas y hormonas útiles a bajo costo. La ingeniería genética se ocupa del estudio (patrón de herencia de enfermedades en el hombre y colección de genes humanos que podrían proporcionar un mapa completo de la herencia de individuos sanos.

La terapia génica mediante la cual se pueden insertar genes sanos directamente en una persona con genes defectuosos es quizás el aspecto más revolucionario y prometedor de la ingeniería genética. El uso de terapia génica ha sido aprobado en más de 400 ensayos clínicos para enfermedades como enfisema de fibras quísticas, distrofia muscular, deficiencia de adenosina desaminasa.

Es posible que algún día se aproveche la terapia génica para curar enfermedades humanas hereditarias como la hemofilia y la fibrosis quística, causadas por genes faltantes o defectuosos. En un tipo de terapia génica, los virus modificados genéticamente insertan nuevos genes funcionales en las células de personas que no pueden producir ciertas hormonas o proteínas para las funciones normales del cuerpo.

La introducción de nuevos genes en un organismo a través de la tecnología del ADN recombinante altera esencialmente la composición de las proteínas y, finalmente, las características corporales.

La tecnología de ADN recombinante también se utiliza en la producción de vacunas contra enfermedades. Una vacuna contiene una forma de organismo infeccioso que no causa una enfermedad grave, pero sí hace que el sistema inmunológico del cuerpo forme anticuerpos protectores contra el organismo infeccioso. Las vacunas se preparan aislando el antígeno o la proteína presente en la superficie de las partículas virales.

Cuando una persona es vacunada contra una enfermedad viral, los antígenos producen anticuerpos que actúan contra las proteínas virales y las inactivan. Con la tecnología del ADN recombinante, los científicos han podido transferir los genes de algunas proteínas de la vaina viral al virus vaccinia que se utilizó contra la viruela.

Las vacunas producidas por clonación de genes están libres de contaminación y son seguras porque solo contienen proteínas de la cubierta contra las que se producen los anticuerpos. Se están produciendo algunas vacunas mediante la clonación de genes, por ejemplo, vacunas contra la hepatitis viral, el virus del herpes simple, la fiebre aftosa inducida por virus en animales.

Hasta hace poco, la hormona insulina se extraía solo en cantidades limitadas del páncreas de vacas y cerdos. El proceso no solo era costoso, sino que la hormona a veces causaba reacciones alérgicas en algunos pacientes con diabetes.

La producción comercial de insulina se inició en 1982 mediante tecnología de ADN biogenético o recombinante y el uso médico de la hormona insulina fue aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de EE. UU. En 1982.

El gen de la insulina humana se ha clonado en grandes cantidades en la bacteria E. coli, que podría usarse para la síntesis de insulina. La insulina modificada genéticamente está disponible comercialmente como humilin.

Las linfocinas son proteínas que regulan el sistema inmunológico en el cuerpo humano, el interferón α es uno de los ejemplos. El interferón se usa para combatir enfermedades virales como la hepatitis, el herpes, los resfriados comunes y el cáncer. Dichos fármacos se pueden fabricar en células bacterianas en grandes cantidades.

Las linfocinas también pueden ser útiles para los pacientes con SIDA. La interleucina II modificada genéticamente, una sustancia que estimula la multiplicación de linfocitos, también está disponible y actualmente se está probando en pacientes con SIDA.

Una hormona polipeptídica de catorce aminoácidos sintetizada por el hipotálamo se obtuvo sólo en una pequeña cantidad de cadáveres humanos. La somatostatina utilizada como fármaco para determinadas anomalías relacionadas con el crecimiento parece ser específica de la especie y el polipéptido obtenido de otros mamíferos no tiene ningún efecto en el ser humano, de ahí su extracción del hipotálamo de cadáveres.

La técnica de ingeniería genética ha ayudado en la síntesis química del gen que se une al ADN del plásmido pBR 322 y se clona en una bacteria. La bacteria transformada se convierte en una fábrica de síntesis de somatostatina. La deficiencia de ADA (adenosina desaminasa) es una enfermedad como la inmunodeficiencia combinada que mató al chico burbuja David en 1984.

Los niños con deficiencia de ADA mueren antes de los dos años. Las células de la médula ósea del niño después de ser extraídas del cuerpo fueron invadidas por un virus inofensivo en el que se insertó ADA.

La eritropoyetina, una hormona modificada genéticamente, se utiliza para estimular la producción de glóbulos rojos en personas que padecen anemia grave.

Producción de factores de coagulación sanguínea.:

Normalmente, el ataque cardíaco se produce cuando las arterias coronarias están bloqueadas por el colesterol o un coágulo de sangre. el plasminógeno es una sustancia que se encuentra en los coágulos sanguíneos. La enzima activadora del plasminógeno tisular (tPA) genéticamente modificada disuelve los coágulos de sangre en personas que han sufrido ataques cardíacos. La proteína activadora del plasminógeno es producida por la empresa de tecnología genética, que es tan potente y específica que incluso puede detener un ataque cardíaco en curso.

El cáncer es una enfermedad temida. Los anticuerpos clonados de una sola fuente y dirigidos a un antígeno específico (anticuerpos monoclonales) han demostrado ser muy útiles en el tratamiento del cáncer. Los anticuerpos monoclonales han sido atacados con elementos radiactivos o citotoxinas como la ricina de la semilla de ricino para hacerlos más mortales. Dichos anticuerpos buscan células cancerosas y las matan específicamente con su radiactividad o toxina.

Ingeniería genética: Aplicación n. ° 3. Producción de energía:

La tecnología del ADN recombinante tiene un enorme alcance en la producción de energía. A través de esta tecnología Ii ahora es posible bioingeniería de cultivos energéticos o biocombustibles que crecen rápidamente para producir una gran biomasa que se usa como combustible o se puede procesar en aceites, alcoholes, diesel u otros productos energéticos.

Los desechos de estos se pueden convertir en metano. Los ingenieros genéticos están tratando de transferir el gen de la celulasa a los organismos adecuados que pueden usarse para convertir desechos como el aserrín y los tallos de maíz primero en azúcar y luego en alcohol.

Ingeniería genética: Aplicación n. ° 4. Aplicación a las industrias:

Las bacterias de diseño genético se utilizan para generar productos químicos industriales. Se pueden sintetizar una variedad de productos químicos orgánicos a gran escala con la ayuda de microorganismos modificados genéticamente. La glucosa se puede sintetizar a partir de sacarosa con la ayuda de enzimas obtenidas de organismos modificados genéticamente.

Hoy en día, con la ayuda de la ingeniería genética, se han desarrollado cepas de bacterias y cianobacterias que pueden sintetizar amoníaco a gran escala que se puede utilizar en la fabricación de fertilizantes a costos mucho más baratos. Se están desarrollando microbios que ayudarán en la conversión de celulosa en azúcar y de azúcar en etanol.

La tecnología de ADN recombinante también se puede utilizar para monitorear la degradación de basura, productos del petróleo, naftaleno y otros desechos industriales.

Por ejemplo, la bacteria pseudomonas fluorescens, alterada genéticamente por la transferencia de la enzima productora de luz llamada luciferasa que se encuentra en la bacteria Vibrio fischeri, produce luz proporcional a la cantidad de su actividad de descomposición del naftaleno, lo que proporciona una forma de controlar la eficiencia del proceso.

El maíz y la soja están muy dañados por el gusano cortador negro. Pseudomonas fluorescens se encuentra asociada con el maíz y la soja. Bacillus thuringiensis contiene un gen patógeno para la plaga. A lo largo de los años, la plaga no solo se ha vuelto peligrosa para los cultivos, sino que ha desarrollado resistencia a varios pesticidas.

Cuando se clonó el gen de B. thuringiensis (Bt) en fluorescencia de pseudomonas y se inoculó en el suelo, se descubrió que la pseudomonas fluorescens modificada genéticamente podía causar la muerte de los gusanos cortadores.


Una caja de herramientas CRISPR-dCas para ingeniería genética y biología sintética

El control programable de la expresión génica es esencial para comprender la función de los genes, diseñar comportamientos celulares y desarrollar terapias. Más allá de las aplicaciones de edición de genes habilitadas por la nucleasa CRISPR-Cas9 y CRISPR-Cas12a, la invención de las moléculas Cas muertas por nucleasa (dCas9 y dCas12a) ofrece una plataforma para el control preciso de la función del genoma sin edición de genes. Se han desarrollado diversas herramientas dCas, que constituyen una caja de herramientas integral que permite interrogar la función de los genes y la modulación de los comportamientos celulares. Esta revisión resume las aplicaciones actuales de las herramientas dCas para la regulación de la transcripción, la ingeniería epigenética, la obtención de imágenes del genoma, las pantallas genéticas y la inmunoprecipitación de cromatina. También destacamos las ventajas y los desafíos existentes de las herramientas actuales de dCas en ingeniería genética y biología sintética, y brindamos perspectivas sobre direcciones y aplicaciones futuras.

Palabras clave: CRISPRi / a dCas9 cribado genético de regulación de genes de ingeniería epigenómica.


Nuevas aplicaciones de herramientas de biología sintética para ingeniería metabólica de cianobacterias

Las cianobacterias son microorganismos prometedores para las biotecnologías sostenibles, pero liberar su potencial requiere una reingeniería radical y la aplicación de técnicas de biología sintética de vanguardia. En los últimos años, los dispositivos y las estrategias disponibles para modificar las cianobacterias han ido en aumento, incluidos los avances en el diseño de promotores genéticos, sitios de unión de ribosomas, riboswitches, proteínas informadoras, sistemas de vectores modulares y sistemas de selección sin marcadores. Debido a estos nuevos conjuntos de herramientas, las cianobacterias se han diseñado con éxito para expresar vías heterólogas para la producción de una amplia variedad de compuestos valiosos. Las cepas de cianobacterias con potencial para ser utilizadas en aplicaciones del mundo real requerirán el refinamiento de los circuitos genéticos utilizados para expresar las vías heterólogas y el desarrollo de modelos precisos que predigan cómo estas vías pueden integrarse mejor en la red metabólica celular más grande. En este documento, revisamos los avances que se han realizado para traducir las herramientas de biología sintética en organismos modelo de cianobacterias y resumimos experimentos y en silico estrategias que se han empleado para incrementar su potencial de bioproducción. A pesar de los avances en biología sintética e ingeniería metabólica durante los últimos años, está claro que se requieren aún más mejoras para que las cianobacterias sean competitivas con los microorganismos heterótrofos para la bioproducción de compuestos de valor agregado.

Palabras clave: cianobacterias genoma modelos a escala ingeniería metabólica fotosíntesis biología sintética.

Cifras

Mecanismos reguladores de promotores inducibles ...

Mecanismos reguladores de promotores inducibles introducidos recientemente en cianobacterias. (A) Expresión génica inducible por arabinosa ...

CRISPR- cas tecnologías utilizadas para ...

CRISPR- cas tecnologías utilizadas para la edición del genoma de las cianobacterias. (A) CRISPR- cas…

Representación esquemática de estrategias de ingeniería ...

Representación esquemática de estrategias de ingeniería que aumentan la actividad fotosintética en cianobacterias. Usando ATP…

Desarrollo de GSM de cianobacterias. Temprano…

Desarrollo de GSM de cianobacterias. Los primeros GSM de cianobacterias se desarrollaron sobre la base de datos bioquímicos ...


La evolución de la ingeniería genética

Estructura de cristal de dibujos animados de la tecnología de edición de genes TALEN. (Crédito: Laboratorio de Gersbach). Crédito: Universidad de Duke

Charles Gersbach, profesor asociado de ingeniería biomédica de la familia Rooney en la Universidad de Duke, dirige un laboratorio que se centra en el desarrollo y la aplicación de herramientas de ingeniería del genoma, especialmente la tecnología basada en CRISPR. CRISPR-Cas es un sistema de defensa bacteriano que permite a las bacterias utilizar moléculas de ARN y proteínas asociadas a CRISPR (Cas) para atacar y destruir el ADN de los virus invasores. El descubrimiento de esta técnica provocó una revolución en la edición del genoma a medida que los investigadores exploraban cómo la herramienta podría usarse para apuntar y editar específicamente el ADN en células humanas.En los años transcurridos desde su descubrimiento, Gersbach y su laboratorio han utilizado esta tecnología para estudiar enfermedades genéticas como la distrofia muscular de Duchenne, controlar con precisión la expresión génica e incluso desarrollar herramientas que pueden hacer que CRISPR sea más preciso.

¿Cómo llegó la ingeniería genética a ser su área de investigación?

Sabía que quería seguir una carrera académica en la que pudiera ayudar a promover la medicina regenerativa y las terapias genéticas y celulares. Quería trabajar en algo que pudiera afectar a muchas áreas diferentes dentro de la bioingeniería, y me di cuenta de que la expresión genética era un componente central de una variedad de investigaciones.

Había diferentes alas en el edificio donde trabajé en la escuela de posgrado, cada una enfocada en la medicina regenerativa en relación con un sistema de órganos en particular. En diferentes partes del edificio, puede mirar carteles para investigaciones cardiovasculares o musculoesqueléticas, o cosas relacionadas con la diabetes o el trabajo neurológico. Todos estos temas implicaban esencialmente intentar que las células hicieran algo interesante. Como ejemplo muy simplificado, si queremos que las células se comporten como células de cartílago, básicamente las golpeamos con fuerza mecánica y esperamos que activen los genes del cartílago, y si queremos que las células se comporten como neuronas, las electrocutamos y esperamos que pone en marcha los genes neuronales. En todos estos casos, aplica estímulos externos y espera que internamente se expresen los genes correctos. Si el objetivo en todas estas áreas es activar y desactivar los genes correctos, tenía curiosidad por saber si había una tecnología mejor o más directa para programar la expresión génica.

CRISPR es una tecnología relativamente nueva. ¿Cómo terminó siendo ese el foco del trabajo de su laboratorio en Duke?

El primer artículo que describía el uso de CRISPR en células humanas se publicó en 2013, por lo que estábamos trabajando con tecnologías que lo precedieron. La primera fue la ingeniería de proteínas con dedos de zinc, que podrían usarse para modificar una región específica del genoma. En ese momento, la gente usaba dedos de zinc para producir factores de transcripción que podían activar y desactivar genes y regular la expresión genética, pero era muy difícil trabajar con la tecnología, por lo que realmente no había despegado, y solo había unos pocos laboratorios. en el mundo que estaba trabajando con él. Pensé que si entrenaba con uno de ellos, entonces el mundo sería mi ostra, así que me entrené en San Diego durante tres años y usé esa experiencia como mi propuesta para comenzar un laboratorio en Duke en 2009.

Dos años después de que comencé en Duke, surgió una nueva tecnología, llamada TALENs, que era otra herramienta que podía producir proteínas para apuntar a secuencias específicas en el genoma. Era mucho más fácil de usar que los dedos de zinc, pero antes de que tuviera la oportunidad de despegar, apareció CRISPR.

CRISPR es muy fácil de usar, por lo que mi viejo sueño de que iba a ser una de las únicas personas en el mundo que sabía cómo hacer estas cosas salió por la puerta. En ese momento pensaba: "Genial, estoy totalmente obsoleto a solo cuatro años de mi carrera académica". Excepto que habíamos acumulado mucha experiencia y sistemas modelo para usar estas herramientas, y tuve la suerte de tener algunos estudiantes y becarios realmente brillantes y trabajadores en el laboratorio, por lo que pudimos tomar rápidamente los reactivos CRISPR y usar ellos para nuestro propio trabajo. El 3 de enero de 2013, los dos primeros artículos que usaban CRISPR en células humanas se publicaron en línea en Science, y tres semanas después ya habíamos obtenido los plásmidos y realizado experimentos basados ​​en CRISPR en nuestro propio laboratorio que funcionaron. Nuestro primer artículo CRISPR llegó seis meses después.

¿Por qué decidió centrarse en utilizar CRISPR para estudiar la distrofia muscular de Duchenne?

El primer proyecto que inició mi laboratorio en 2009 fue la edición de genes para la distrofia muscular de Duchenne utilizando la tecnología de dedos de zinc. La DMD es la enfermedad genética hereditaria más común, pero en 2009 realmente no había terapias u opciones disponibles para ayudar a las personas con la enfermedad, que causa la degeneración progresiva de sus músculos. También era un profesor asistente nuevo, así que quería hacer algo que estuviera dos pasos por delante de lo que todos los demás estaban viendo, pero tenía que ser un objetivo lo suficientemente tangible para que pudiéramos hacer un progreso claro y la edición de genes para músculos la distrofia estaba en consonancia con esos criterios.

Anteriormente, la gente había buscado formas de modificar las células madre y volver a colocarlas en el músculo, pero reemplazar todas las células musculares del cuerpo no es realmente factible. También tenían virus modificados para transportar genes al músculo, pero el gen que está mutado en este caso es también uno de los genes más grandes del genoma humano, por lo que no encaja en los vectores típicos de la terapia génica. En cambio, la idea de arreglar la copia del gen que ya está en el genoma, en lugar de intentar entregarlo, parecía una oportunidad atractiva. Así que trabajamos en ese enfoque y, de hecho, usamos dedos de zinc y TALEN hasta que se descubrió la edición de genes basada en CRISPR y vimos lo fácil que era de usar.

Nuestro trabajo con la distrofia muscular de Duchenne continúa. Recientemente publicamos un artículo en Medicina de la naturaleza que demostró que un solo tratamiento sistémico podría corregir la mutación de DMD durante más de un año en ratones.

¿Cuáles son las cosas que no puede hacer hoy con CRISPR que desea poder hacer?

Creo que sería útil editar genes sin cortar el genoma. La solución a ese problema puede involucrar una nueva versión de CRISPR, o puede involucrar algo completamente diferente. Pero estamos aprendiendo más sobre estos sistemas todos los días; hace diez años, hacía falta dos años para hacer un proyecto que involucraba la edición de genes, y ahora puedes hacerlo en una semana o dos. Hay muchos sabores de CRISPR, donde Cas9 es la proteína más utilizada, pero los investigadores han descubierto docenas de otros tipos de Cas9 e incluso otras proteínas y complejos CRISPR, incluidos Cas12, Cas13, Cas14, Cas3 e incluso Cascade, y cada uno de ellos. estos sistemas se prestan a un uso único.

De cara al futuro con CRISPR, ¿qué es lo que más le entusiasma?

Los primeros ensayos clínicos de CRISPR en humanos han comenzado este año. Estamos viendo los primeros ensayos para el cáncer, la anemia de células falciformes y las formas raras y hereditarias de ceguera. Y tendremos los resultados de esas pruebas en el próximo año o dos, por lo que es muy emocionante y definitivamente está cerca de la parte superior de la lista.

También creo que ahora estamos en un lugar en el que CRISPR se ha integrado completamente en el proceso de desarrollo de fármacos. No solo CRISPR como terapia, sino CRISPR para crear sistemas modelo y líneas celulares para ayudar a diseñar mejores medicamentos. Creo que CRISPR tendrá un impacto dramático en la medicina de una manera que va más allá del uso de CRISPR directamente como terapia. De hecho, iniciamos una empresa, Element Genomics, para hacer esto facilitando el desarrollo de fármacos con estas herramientas, no para usar necesariamente CRISPR como terapia. Eso es sutil, por lo que la gente no necesariamente aprecia que cosas como CRISPR estén trabajando en segundo plano para hacer que la investigación biológica sea más avanzada para ayudar a encontrar nuevos medicamentos.


Ver el vídeo: INGENIERÍA GENÉTICA Y BIOTENOLOGÍA - Clonación, terapia génica, transgénicos, PCR, bioética (Enero 2022).