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¿Puede una célula perder completamente la capacidad de sufrir apoptosis?

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Lo que quiero decir es: ¿puede una supercélula cancerosa perder por completo la capacidad de matarse a sí misma, perder todos los mecanismos relacionados con la apoptosis y volverse eternamente resistente a cualquier fármaco que intente inducir la apoptosis directa o indirectamente?


Apoptosis versus necrosis

Mientras que apoptosis es una forma de muerte celular que generalmente se desencadena por procesos normales y saludables en el cuerpo, necrosis es la muerte celular desencadenada por factores externos o enfermedades, como traumatismos o infecciones. La apoptosis, que también puede ocurrir como mecanismo de defensa durante los procesos de curación, es casi siempre normal y beneficiosa para un organismo, mientras que la necrosis siempre es anormal y dañina. Aunque se está investigando la necrosis como una posible forma de muerte celular programada (es decir, un proceso a veces natural), en este momento se considera un proceso de muerte celular "no programado" (no natural). Como una forma generalmente saludable del ciclo de vida de una célula, la apoptosis rara vez exige algún tipo de tratamiento médico, pero la necrosis no tratada puede provocar lesiones graves o incluso la muerte.


Canales iónicos y apoptosis en cáncer

Los seres humanos mantienen un número de células constante durante toda su vida. Este equilibrio del número de células se logra cuando la proliferación celular y la muerte celular se mantienen equilibradas, logrando un número de células en estado estable. Las anomalías en el crecimiento celular o la muerte celular pueden provocar una sobreabundancia de células conocida como neoplasma o tumores. Si bien la percepción del cáncer es a menudo la de una tasa incontrolable de crecimiento celular o un aumento de la proliferación, una disminución de la muerte celular también puede conducir a la formación de tumores. La mayoría de las células mueren cuando se desprenden de su tejido normal. Sin embargo, las células cancerosas evaden la muerte celular, inclinando la balanza hacia una sobreabundancia de número de células. Por tanto, la superación de esta resistencia a la muerte celular es un factor decisivo en el tratamiento del cáncer. Los canales iónicos desempeñan un papel fundamental en el cáncer en lo que respecta a la proliferación celular, la angiogénesis maligna, la migración y la metástasis. Además, también se sabe que los canales iónicos son componentes críticos de la apoptosis. En esta revisión, discutimos los modos de muerte celular centrándonos en la capacidad de las células cancerosas para evadir la apoptosis. Específicamente, nos enfocamos en el papel que juegan los canales iónicos en el control y regulación de las decisiones de vida / muerte y cómo pueden usarse para superar la resistencia a la apoptosis en el tratamiento del cáncer.

1. Introducción

El cáncer no es solo una enfermedad, sino que se puede clasificar en varias categorías amplias según el sitio de origen de las células cancerosas, como carcinoma (piel o tejidos que recubren los órganos internos), sarcoma (hueso, cartílago, tejido conjuntivo o de soporte), leucemia. (tejido formador de sangre) y linfoma o mieloma (sistema inmunológico). El cáncer generalmente se considera una replicación incontrolable de células anormales que son capaces de invadir los tejidos circundantes o distantes. Dentro de un tejido, la proximidad de las células entre sí permite la señalización paracrina y endocrina esencial que se requiere para la supervivencia. Las células que se liberan o se desprenden de un sitio o tejido primario pierden esta señal de red vital y típicamente sufren apoptosis, mientras que las células malignas pueden hacer frente a su nuevo entorno y sobrevivir.

2. Apoptosis versus necrosis

Las células muertas que se encuentran en exceso del recambio celular normal se han considerado tradicionalmente necróticas, lo que indica una anomalía o desviación en la homeostasis del tejido normal. Históricamente, la necrosis ha sido un término utilizado para describir un modo accidental de muerte celular resultante de daño químico, agresiones tóxicas contundentes o lesiones físicas. Este proceso de muerte celular pasiva se caracteriza principalmente por su morfología celular inflamada distinta que resulta de una pérdida temprana de energía [1, 2]. Esta muerte celular catastrófica resultante del agotamiento de ATP carece de la descomposición organizada del contenido celular observado en otros modos más programados de muerte celular. Además de la hinchazón celular, las células necróticas degradan aleatoriamente su ADN, ARN y proteínas, tienen un influjo masivo de calcio, pierden la integridad de la membrana, lo que desencadena una respuesta inflamatoria en el área que rodea a la célula moribunda.

A principios de la década de 1970, las observaciones morfológicas iniciales de Kerr et al. [3] describir la capacidad de una célula para implosionar y desintegrarse llevó al concepto de un proceso de muerte celular activo, inherentemente controlado, ahora conocido como apoptosis. Este modo fisiológico, y lo que es más importante, no inflamatorio de muerte celular, también se observó en tejidos de animales sanos [4-6], en neoplasias malignas no tratadas [7] y en la atrofia de órganos al agregar o retirar hormonas [ 5,8]. Por lo tanto, se describió un modo de muerte celular en el que la división celular equilibrada proporciona un mecanismo para que el cuerpo mantenga la homeostasis celular adulta.

Se sabe que la apoptosis es una muerte celular organizada y se ha demostrado que desempeña un papel importante en la embriogénesis, el desarrollo de tejidos y órganos y en diversos estados patológicos, por ejemplo, el cáncer. La apoptosis se caracteriza por un conjunto único de características morfológicas y bioquímicas que la distinguen de otras formas de muerte. Estas características incluyen la contracción celular, la condensación nuclear, la escisión del ADN en la región enlazadora de los nucleosomas adyacentes y la formación de ampollas en la membrana [9]. Se observaron otras características bioquímicas que definieron la apoptosis, como la externalización de la fosfotidilserina de la membrana, la liberación de citocromo C de las mitocondrias y la activación de una familia específica de proteasas conocidas como caspasas [2, 9, 10]. Las células apoptóticas se eliminan del organismo de manera oportuna y ordenada, a través de la fagocitosis, lo que resulta en la ausencia de una respuesta inflamatoria. Si bien no todas las características que clasifican la apoptosis se observan en todas las condiciones, la idea de un proceso de muerte celular programada, codificada internamente y precisa permanece constante.

Las células cancerosas evaden la apoptosis al desprenderse de las células vecinas, se diseminan a otras partes del cuerpo a través de los sistemas linfático o vascular, lo que resulta en el desarrollo de metástasis. El término anoikis se ha utilizado para describir la apoptosis que se produce por el desprendimiento de células dependientes del anclaje y desempeña un papel importante en la tumorigénesis, alterando el equilibrio entre la proliferación celular y la muerte celular. Teniendo en cuenta las numerosas formas en que una célula puede morir, vencer la resistencia a la apoptosis o la activación del programa apoptótico sería el medio más beneficioso para eliminar las células malignas del cuerpo.

3. Otros modos de muerte celular

Si bien distintas características diferencian claramente la apoptosis de la necrosis (tabla 1), la evidencia creciente sugiere que estos dos modos de muerte celular representan los extremos de una amplia gama de muertes programables, con numerosas variaciones de células moribundas que se encuentran en el medio (figura 1). Estudios recientes han sugerido un tipo programable de necrosis que está lejos de ser aleatorio en su modo de acción [11-13]. Esta variación de la necrosis, denominada necrosis programada, muerte celular independiente de caspasa o necroptosis, se produce por la muerte del receptor o por infección viral, en ausencia de activación de la caspasa [14]. Las células necroptóticas exhiben varias características de necrosis que incluyen hinchazón celular, disfunción de orgánulos y lisis celular, pero estos eventos parecen ocurrir de una manera más ordenada. De manera similar, un modo pasivo de muerte celular conocido como oncosis o "muerte celular isquémica" se desencadena por daños químicos, térmicos o por radiación que van más allá del punto de reparación celular [15]. La oncosis se define por la inflamación de las mitocondrias, el núcleo y el citoplasma, junto con la vacuolización citoplasmática, y se cree que implica la falla de las bombas iónicas en la membrana plasmática antes de la pérdida de la integridad de la membrana (figura 1). La piroptosis, una forma programada de muerte celular, se asocia con respuestas antimicrobianas durante la inflamación y requiere la activación de caspasa específica [16]. Observados solo en macrófagos y células dendríticas comprometidas con patógenos microbianos, los receptores tipo NOD en estas células reconocen patrones moleculares asociados a patógenos intracitoplasmáticos para promover el ensamblaje en el piroptosoma, también conocido como inflamasoma, un complejo de múltiples proteínas que recluta y activa la caspasa. -1 (figura 1 y tabla 1). Finalmente, la autofagia es un proceso catabólico conservado evolutivamente que juega un papel no solo en la muerte de una célula, sino también en la supervivencia celular [17,18]. Como mecanismo de supervivencia celular, la autofagia intenta mantener la homeostasis intracelular durante los períodos de inanición mediante el reciclaje de componentes celulares (figura 1 y tabla 1). Sin embargo, en varios estados patológicos, incluidos el Alzheimer y el Parkinson, se observan con frecuencia células autofágicas [19,20], lo que sugiere que la autofagia también puede considerarse un programa suicida. Claramente, hay muchas formas en que una célula puede morir, por lo que activar o reprimir la apoptosis en las células cancerosas sería beneficioso para el tratamiento del cáncer debido a la integridad de la membrana conservada, la formación de cuerpos apoptóticos y la falta de una respuesta inflamatoria (tabla 1).

Tabla 1. Comparación de los procesos de muerte celular con respecto a la presencia o ausencia de características definitorias.

Figura 1. Modos de muerte celular. La apoptosis y la necrosis comprenden extremos opuestos de un continuo de modos programables y no programables de muerte celular. La autofagia, la piroptosis y la oncosis (muerte celular isquémica) representan un rango de muerte celular que conserva algunas características de la apoptosis o la necrosis, pero definen un modo único de muerte celular. (Versión online en color).

4. Activación y represión de la apoptosis

En general, dos vías celulares conducen a la activación de la apoptosis. La primera es una vía mediada por receptores conocida como vía extrínseca, donde los receptores de muerte de la superficie celular señalan a la maquinaria apoptótica para promover la activación de proteasas específicas, conocidas como caspasas, lo que conduce a la degradación celular y eventualmente a la formación de cuerpos apoptóticos [21]. Los receptores de muerte predominantes son de la familia de proteínas TNF e incluyen el receptor 1 de TNF (TNF-R1, p55, CD120a), Fas (CD95, APO-1) y los receptores de ligandos inductores de apoptosis relacionados con TNF (TRAIL-R1, DR4 TRAIL-R2, DR5, APO-2). El núcleo de esta vía de señalización implica la formación del complejo de señalización inductor de muerte (DISC) que comprende un receptor de muerte, la proteína adaptadora FADD y una caspasa iniciadora [22]. La activación de estas caspasas iniciadoras a nivel de DISC conduce a la activación adicional de caspasas efectoras o aguas abajo después de la apoptosis.

La segunda vía de activación apoptótica se conoce como vía intrínseca que implica la liberación de factores apoptógenos como el citocromo. C, factor inductor de apoptosis y segundo activador derivado de la caspasa de la mitocondria [23]. Las señales de muerte convergen a nivel de las mitocondrias para liberar estos factores durante el inicio de la apoptosis. El núcleo de esta vía de señalización implica la formación del apoptosoma que comprende la procaspasa-9, la proteína adaptadora Apaf-1 y el citocromo. C [24,25]. Sin embargo, las vías extrínseca e intrínseca de la apoptosis no son mutuamente excluyentes ya que la caspasa 8 activada a través de la vía extrínseca puede escindir la proteína proapoptótica BID para provocar la activación de componentes de la vía apoptótica intrínseca [26, 27].

Se han identificado varios mecanismos celulares y proteínas que funcionan en numerosos niveles del proceso de muerte celular para prevenir o inhibir la apoptosis [28]. La actividad de la caspasa puede inhibirse mediante la expresión de las proteínas virales Cp-IAP y Op-IAP que definen una familia de inhibidores de las proteínas de apoptosis (IAP) [29-31]. Se cree que las IAP funcionan uniéndose directamente a las caspasas durante la apoptosis, donde los miembros específicos de la familia de las IAP interactúan con caspasas específicas para prevenir la apoptosis. Además, los miembros antiapoptóticos de la familia de proteínas Bcl-2 (Bcl-XL, Bcl-w y Mcl-1) residen en la membrana mitocondrial externa e inhiben la apoptosis al prevenir la activación de una subfamilia de proteínas proapoptóticas solo BH3, como Bax y Bak [32]. Mediante la interacción de las proteínas antiapoptóticas con Bax y Bak, los factores proapoptóticos se mantienen bajo control y no se liberan de las mitocondrias [33]. Además, la regulación a la baja de la expresión de estos factores proapoptóticos también puede contribuir a la resistencia apoptótica. Finalmente, se sabe que mantener una alta fuerza iónica intracelular previene la apoptosis al inhibir la liberación de citocromo. C y la formación del apoptosoma [34,35].

5. Iones y apoptosis

Independientemente de la ruta específica que las células puedan emplear para sufrir la apoptosis, en general, tanto la ruta extrínseca como la intrínseca conducen a eventos análogos que incluyen el encogimiento celular, la fragmentación del ADN internucleosómico y la formación de cuerpos apoptóticos. Una característica de la apoptosis es la pérdida de volumen celular o la contracción celular [36-38], denominada disminución del volumen apoptótico (AVD) [39]. Se ha demostrado que la pérdida de volumen celular o AVD durante la apoptosis es el resultado de cambios en los iones intracelulares, y la pérdida de potasio intracelular desempeña un papel fundamental en la activación posterior de la maquinaria apoptótica [34,35,40,41]. La disminución del volumen celular es el resultado de una disminución de la fuerza iónica intracelular general que permite la activación de la caspasa, la formación de apoptosomas y la actividad nucleasa apoptótica.

Si bien la pérdida de potasio intracelular ha sido bien documentada en muchos sistemas de modelos apoptóticos, el mecanismo exacto por el cual se produce esta depleción de potasio no está completamente resuelto. Se ha descrito que numerosos canales de potasio, incluidos los canales de potasio rectificadores retardados y reguladores de entrada de voltaje, desempeñan un papel durante la activación de la apoptosis [37,38,42] y la inhibición directa de los canales de potasio mediante el uso de tetretilamonio, tetrapentilamonio o quinina. puede proteger a las células de la muerte celular [43-45]. Estos datos sugieren que distintos canales de potasio están implicados en la apoptosis según el tipo de célula o el estímulo de muerte celular.

El sodio y el cloruro también participan durante la apoptosis. Específicamente, se ha informado de un aumento del sodio intracelular en las primeras etapas del proceso de muerte celular [46-49]. La inhibición de este aumento de sodio intracelular previene la apoptosis. En estudios en los que se ha eliminado el sodio del entorno extracelular, se ha demostrado que la apoptosis se produce en ausencia de contracción celular [48,49], lo que sugiere que el flujo de sodio durante la apoptosis juega un papel importante en el control del tamaño celular. También se ha informado de flujo de cloruro durante la apoptosis [50-52]. Se demostró que la modulación del flujo de cloruro altera la vía intrínseca de la inducción apoptótica, mientras que no tiene ningún efecto sobre la vía extrínseca [51]. Recientemente, también se ha propuesto un canal de cloruro rectificador hacia el exterior (VSOR) sensible al volumen como conductancia aniónica primaria durante la apoptosis [53].

Claramente, los canales de iones y los transportadores juegan un papel central en el control del volumen celular para prevenir la muerte celular. El volumen celular y su regulación también desempeñan un papel fundamental en una serie de funciones moleculares y celulares que incluyen la proliferación, la migración, la liberación de hormonas y la expresión génica [54,55]. Estos hallazgos sugieren que las células han desarrollado mecanismos protectores esenciales para mantener controlado el equilibrio de iones intracelulares y extracelulares en respuesta a cambios en su entorno extracelular, que se conocen colectivamente como respuestas reguladoras de volumen [54,56]. Con respecto a la apoptosis, la ausencia de regulación de volumen en los linfocitos humanos contribuye a la activación rápida e independiente del estímulo de la apoptosis [57]. Además, la desregulación de los mecanismos reguladores del volumen celular inherente puede contribuir a la AVD [39], y la inhibición de los canales catiónicos inducidos por la hipertonicidad puede sensibilizar a las células HeLa para que sufran apoptosis [58]. Por tanto, la capacidad de una célula para controlar su volumen celular y su homeostasis iónica juega un papel crítico en la activación y represión de la apoptosis.

6. Superar la resistencia a la apoptosis en las células cancerosas.

La resistencia a la apoptosis puede presentarse en numerosas formas, y cada tipo individual de cáncer puede utilizar un mecanismo diferente para obtener esta insensibilidad a la muerte celular. Por tanto, la capacidad de superar la resistencia a la apoptosis en las células tumorales es el objetivo de la mayoría de las terapias contra el cáncer. Una cuestión importante es cómo superar estos bloques moleculares que utilizan las células resistentes para escapar de este proceso inherente de muerte celular.

Se sabe que la inhibición de las vías apoptóticas extrínsecas e intrínsecas se produce en las células cancerosas de metástasis tumoral [59], y la superación de esta resistencia ha sido un foco de la terapia tumoral [60]. Por ejemplo, los estudios han demostrado que la Apo2L / TRAIL humana recombinante puede inducir la apoptosis en varios tipos de células cancerosas sin afectar a la mayoría de las células normales [61,62]. Aunque no es eficaz en todos los tipos de cáncer, esta estrategia evita la mutación común en el gen supresor de tumores p53, ya que la señalización del receptor de muerte funciona independientemente de p53 [63]. Además, la vía intrínseca también ha sido un objetivo en la terapia contra el cáncer donde se ha estudiado la modulación biológica de los miembros de la familia Bcl-2 para superar la resistencia a la apoptosis [64,65]. Estas modulaciones han incluido el uso de oligonucleótidos antisentido Bcl-2 [66], miméticos de BH3 [67], inhibidores de moléculas pequeñas de proteínas Bcl-2 antiapoptóticas [68]. Sin embargo, la maquinaria apoptótica específica para el direccionamiento, como los receptores de muerte, los miembros de Bcl-2 antiapoptóticos o incluso las caspasas, solo serían beneficiosas para las células cancerosas que emplean estos componentes específicos. Por lo tanto, un enfoque para superar la resistencia a la apoptosis en las células cancerosas sería apuntar a un evento de muerte celular común involucrado con la vía extrínseca e intrínseca. Dado que los canales iónicos desempeñan un papel importante en ambas vías apoptóticas, apuntar a los canales iónicos para superar la resistencia a la apoptosis debería ser muy prometedor en el tratamiento de las células cancerosas independientemente de una vía específica de muerte celular.

7. Canales de potasio como objetivos de la muerte celular apoptótica en células cancerosas

Claramente, los canales iónicos juegan un papel fundamental en muchas características del cáncer [69], incluidos los seis fenotipos fisiopatológicos del crecimiento maligno [70]. Por ejemplo, se sabe que los canales de potasio desempeñan un papel fundamental en la proliferación celular [71,72]. Se informó que los primeros estudios de infección viral y células transformadas con H-ras que producían alteraciones oncogénicas aumentaron la actividad de los canales de potasio [73,74], y la migración celular depende de la actividad de los canales de potasio [75,76]. Un análisis extenso de microarrays de tejido de cáncer de mama, la subunidad a del voltaje de gran conductancia y el canal de potasio activado por calcio (KCNMA1) mostró una expresión mejorada que puede contribuir a una alta tasa de proliferación y malignidad [77]. Sorprendentemente, sólo recientemente se han explorado los canales iónicos como dianas para sensibilizar a las células cancerosas resistentes a la apoptótica debido a su función única en la activación del programa de muerte celular [78-81].Una dificultad para dirigirse a canales iónicos individuales en la terapia del cáncer es determinar qué canales están involucrados para un tipo celular específico y una vía apoptótica. Varias revisiones excelentes sobre los canales iónicos y el cáncer, incluidas las de esta monografía, se han centrado en su papel en las diferentes etapas de la progresión tumoral, incluido el crecimiento y la proliferación celular, la motilidad y la invasión, y / o su papel en diferentes tipos de tumores [82-84 ]. Aquí, nos centramos en los canales iónicos para superar la resistencia a la apoptosis en el cáncer.

Los canales de potasio son la familia de canales iónicos más grande, diversa y mejor estudiada y han sido un foco importante para la terapia del cáncer debido a su papel en la proliferación celular, la diferenciación, la regulación del volumen celular y el mantenimiento del potencial de membrana. Existe un conjunto exhaustivo de canales de potasio, y la expresión de estos canales difiere no solo por tipo de célula, sino también de células normales a metastásicas del mismo tipo de célula [85]. Se sabe que varios canales de potasio activados por voltaje, incluidos Kv1.1, Kv1.3, Kv1.5, Kv2.1 y Kv11.1, desempeñan un papel fundamental durante la apoptosis [86], con Kv1.3 y Kv1.5 recibiendo la mayor atención debido a su participación conocida en la progresión del ciclo celular y la señalización del calcio [87,88]. Además de los canales iónicos activados por voltaje, otros miembros de la familia de los canales de potasio tienen el potencial de tener un papel en la apoptosis. La Tabla 2 proporciona una lista de canales de potasio que se sabe que desempeñan un papel durante la apoptosis en las células cancerosas.

Tabla 2. Canales de potasio: su papel en la apoptosis y el cáncer.

Una comprensión completa de los canales de potasio en el contexto de una variedad de vías apoptóticas es de primordial importancia para restaurar la sensibilidad a la muerte celular en las células tumorales. Por ejemplo, un informe reciente que utilizó células de glioblastoma humano mostró que la apoptosis inducida por estaurosporina (vía intrínseca) se produjo a través de canales de potasio (IK) activados por calcio de conductancia intermedia, mientras que la muerte celular inducida por TRAIL (vía extrínseca) utilizó calcio de gran conductancia canales de potasio activados (BK) [104]. Por lo tanto, el clotrimazol y el TRAM-34 (bloqueadores de IK) fueron efectivos para prevenir la apoptosis inducida por estaurosporina, mientras que la paxilina (bloqueador de BK) fue completamente ineficaz. El desarrollo de tratamientos terapéuticos adecuados para prevenir el crecimiento del cáncer requiere un conocimiento profundo de la complejidad del canal iónico para un tipo de célula dado, así como los mecanismos de señalización proporcionados por el agente de quimioterapia empleado.

Como se indicó anteriormente, durante la apoptosis ocurre una salida de potasio intracelular, el catión intracelular dominante, lo que resulta en la pérdida de volumen celular (AVD) y la activación de la maquinaria apoptótica. Por ejemplo, una célula cancerosa puede evadir la apoptosis simplemente regulando a la baja estos canales de potasio. Curiosamente, Kv1.3 y Kv1.5 se expresan a niveles reducidos en muchos tipos de cánceres humanos [105], lo que sugiere que estos canales iónicos pueden contribuir a la resistencia apoptótica. Por tanto, la sobreexpresión dirigida de los canales de potasio dependientes de voltaje puede dar como resultado una respuesta proapoptótica al proporcionar un mecanismo para reducir la fuerza iónica intracelular global que es importante para superar la resistencia apoptótica.

Además, la expresión de proteínas que modulan los canales iónicos también puede ser beneficiosa para restaurar la sensibilidad apoptótica. Por ejemplo, la proteína moduladora del canal de potasio KChAP cuando se sobreexpresa en una línea celular de cáncer de próstata, las células LNCaP, dio como resultado un aumento de la expresión del canal de potasio, una disminución del tamaño celular medio que aumentó la AVD y promovió la apoptosis espontánea [106]. La sobreexpresión repetitiva de KChAP en xenoinjertos de LNCaP o DU-2145 suprimió significativamente el crecimiento tumoral debido al aumento de la apoptosis. Si bien la sobreexpresión de KChAP en células LNCaP también resultó en una detención del ciclo celular G0 / G1 a través de la activación de p53, las células DU-2145 expresan una p53 mutada, no funcional, descartando así a p53 como la razón de la muerte celular. Como ambas líneas celulares mostraron un aumento de la apoptosis, se determinó que la acción de la proteína moduladora de KChAP era el resultado de la interacción directa con el canal de potasio.

Si bien la intervención directa a nivel de los canales iónicos puede ser beneficiosa, las consecuencias indirectas de la inhibición del canal también pueden sensibilizar a las células tumorales a la apoptosis. La inhibición indirecta de los canales de potasio activados por Ca2 + de gran conductancia (canales BK) en las células cancerosas HeLa y A2780 indujo la apoptosis de las células tumorales [107]. Aunque contradictorio con la salida de potasio intracelular, el mecanismo de activación apoptótica a través de la inhibición del canal de potasio en estas células se produjo a través del aumento de la expresión de p53, p21 y Bax. Por tanto, la intervención a nivel de los canales iónicos también puede tener efectos beneficiosos indirectos que dan como resultado la activación de la apoptosis.

Los canales de iones ubicados en las membranas intracelulares también pueden tener un papel funcional durante la apoptosis. Kv1.3 se expresa en las mitocondrias de los linfocitos [108], donde su ubicación en la membrana mitocondrial interna permite una interacción directa con Bax, una proteína proapoptótica [109]. La inhibición de mtKv1.3 a través de la unión de Bax da como resultado la hiperpolarización del potencial de membrana de las mitocondrias, la liberación de citocromo. C y la producción de especies reactivas de oxígeno que conducen a la apoptosis. También se ha informado de la presencia de mtKv1.3 en las líneas celulares de cáncer de próstata y de mama, PC3 y MCF-7, respectivamente [110]. Curiosamente, la inhibición farmacológica de mtKv1.3 con fármacos que penetran la membrana indujo la apoptosis en una variedad de líneas de células cancerosas de una manera independiente de Bax / Bak y redujo el tamaño del tumor en un 90% en un modelo de ratón con melanoma ototópico [101], lo que sugiere que el direccionamiento de este canal iónico específico en células tumorales sería ventajoso en condiciones de proteínas proapoptóticas inactivas o no funcionales. Además, se ha informado de que Kv1.1 y Kv1.5 también interactúan con Bax porque los linfocitos deficientes en Kv transfectados con estos canales iónicos restauran la sensibilidad a la muerte celular en células CTLL-2 resistentes a la apoptosis [111]. Los macrófagos J774 también expresan Kv1.3 y Kv1.5 en sus mitocondrias y la regulación a la baja del ARNip o la inhibición farmacológica de estos canales induce la apoptosis [111]. Estos datos proporcionan una vía para el agotamiento de los macrófagos asociados a tumores que se sabe que fomentan el crecimiento tumoral.

8. Canales de sodio como dianas para la muerte celular apoptótica en células cancerosas.

Si bien la mayor parte de la atención se ha centrado en los canales de potasio en el desarrollo metastásico, la contribución de otros canales iónicos, incluidos los canales de sodio y cloruro, no se ha pasado por alto por completo [81,83,84]. También se cree que los canales de sodio activados por voltaje desempeñan un papel en la proliferación, migración y adhesión de las células tumorales y se expresan en varios carcinomas agresivos [84]. Se ha observado un aumento del sodio intracelular durante la etapa inicial de la apoptosis que se acopla a una disminución inicial del potasio intracelular [47]. Aunque las células Jurkat cultivadas en medios libres de sodio se hinchan en lugar de encogerse cuando se estimulan para sufrir la muerte celular, aún conservan otras características clásicas de la apoptosis [48]. La reintroducción de sodio dio como resultado la morfología apoptótica y encogida. Además, se demostró que la saxitoxina, bloqueadora de los canales de sodio dependiente de voltaje, previene la apoptosis inducida por el ligando Fas en las células Jurkat [48]. Es esencial realizar más estudios sobre el papel del sodio durante la apoptosis, pero la evidencia actual sugiere que los canales de sodio podrían ser objetivos prometedores en la terapia del cáncer con respecto a la sensibilización de las células tumorales para que mueran.

9. Canales de cloruro como dianas para la muerte celular apoptótica en células cancerosas.

Se sabe que los canales de cloruro tienen un papel importante en una amplia variedad de funciones celulares, incluida la proliferación celular, el potencial de membrana, las secreciones de fluidos y la regulación del volumen celular [112]. Además, se sabe que los canales de cloruro desempeñan un papel importante durante la apoptosis [50-52], sin embargo, han recibido una atención considerablemente menor que su homólogo de potasio. La actividad de los canales de cloruro se ha observado en una gran variedad de tipos de células que experimentan apoptosis por vía extrínseca o intrínseca [113]. Al igual que otros canales iónicos, la inhibición de los canales de cloruro para prevenir la apoptosis ha sido específica del tipo de célula y / o del estímulo [51]. Los primeros estudios informaron de la importancia de los canales de cloruro durante la apoptosis, donde la vía del receptor de la muerte activaba un canal de cloruro dependiente de la tirosina quinasa cuya inhibición provocaba una disminución de la muerte celular [114]. Curiosamente, se demostró que la salida de cloruro deficiente inducida por una variedad de estímulos de muerte celular previene la fragmentación del ADN internucleosómico, pero no otras características clásicas de la muerte celular programada [115]. Se ha informado que los canales de cloruro activados por calcio (CaCC) son proapoptóticos y suprimen la formación de tumores en las células epiteliales [116]. Sin embargo, otros miembros de la familia de los CaCC junto con el CaCC activado por el receptor 8-transmembrana recientemente caracterizado (TMEM16A) pueden promover la proliferación celular y la tumorigénesis [117,118]. Estos estudios sugieren un papel variable del cloruro y / o la corriente aniónica durante la apoptosis y la progresión del cáncer.

Recientemente, los canales de cloruro de VSOR, que se sabe que se activan con la inflamación celular, están activos durante la AVD [119]. Se informó que la inhibición de estos canales previene la AVD y los eventos apoptóticos subsiguientes [52]. Los canales de cloruro, como es el caso de los canales de potasio, también se pueden expresar en las membranas intracelulares [112]. Una disminución en la expresión de estos canales de cloruro utilizando construcciones antisentido resultó en apoptosis tras el tratamiento con TNF-alfa [120]. Se sabe que una variedad de corrientes aniónicas están presentes en muchos cánceres y la actividad de los canales de cloruro ocurre durante la muerte celular. Sin embargo, el direccionamiento de los canales de cloruro en las células tumorales para restaurar la sensibilidad a la apoptosis es limitado debido a la identidad molecular desconocida de muchas de estas proteínas. La dificultad para determinar la identidad de los canales de cloruro probablemente esté relacionada con los datos recientes que sugieren que muchas de estas proteínas son anti-portadores y no solo canales [112].

10. Conclusión

En retrospectiva, está claro que las células dedican una gran cantidad de tiempo y energía a mantener su entorno iónico. Todas las células tienen la capacidad de morir, sin embargo, la resistencia a la muerte celular, específicamente la apoptosis, no es monogénica. El entorno físico intracelular de las células normales no favorece la apoptosis. Por tanto, se requiere un cambio en los iones intracelulares para la activación y actividad completas de la apoptosis. Este cambio en el ion intracelular puede permitir la despolarización de la membrana plasmática alterando así las vías de transducción de señales. Además, un cambio en el entorno iónico celular puede alterar las interacciones proteína-proteína. Si bien los iones intracelulares pueden controlar el volumen de la célula, no es un cambio en el tamaño de la célula lo que regula la apoptosis, sino un cambio en el entorno iónico intracelular que tiene la clave para determinar si una célula vive o muere.

Declaración de financiación

Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural de los NIH, Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental.


La familia BCL-2

La familia BCL-2 está formada por reguladores críticos de la vía apoptótica que residen aguas arriba del compromiso irreversible con la muerte celular. Muchos miembros de la familia BCL-2 residen principalmente en las membranas subcelulares, incluida la membrana externa de las mitocondrias, el retículo endoplásmico y la membrana nuclear. La familia consta de agonistas y antagonistas de la muerte que comparten homología de secuencia dentro de α-segmentos helicoidales denotados como dominios de homología de BCL-2 (BH) numerados BH1-4. Miembros de la familia antiapoptóticos (como BCL-2, BCL-XL, A1 y MCL-1) están muy conservados y poseen cuatro dominios BH. Estructuralmente, los dominios BH1-3 forman un bolsillo hidrofóbico capaz de unirse a los dominios BH3 de otros miembros de la familia. Los miembros proapoptóticos pueden subdividirse adicionalmente según el número de dominios BH que poseen. Los miembros proapoptóticos multidominio (BAX, BAK y BOK) poseen los dominios BH1–3 y también forman un bolsillo hidrofóbico. Por el contrario, el subconjunto "solo BH3" de proapoptóticos (BID, BAD, BIM, BIK, BMF, NOXA y PUMA) posee solo el dominio BH3 mínimo. Las proteínas solo BH3 son candidatas atractivas para controlar la apoptosis, ya que están reguladas dinámicamente por varios mecanismos, incluido el control transcripcional y el control postraduccional (revisado por Willis et al. 16 ).

Las moléculas proapoptóticas multidominio BAX y BAK constituyen una puerta de entrada necesaria a la vía mitocondrial de la apoptosis en el sentido de que las células doblemente deficientes para ambas proteínas son dramáticamente resistentes a una amplia gama de señales de muerte. 17, 18 Al recibir señales de muerte, BAX y BAK se activan y oligomerizan en las mitocondrias, lo que da como resultado la permeabilización de la membrana externa y la liberación de citocromo. C (Figura 2). 19 Las moléculas de solo BH3 requieren BAX y BAK para mediar en la muerte y operar aguas arriba de las mitocondrias conectando las señales proximales de muerte y supervivencia a la vía intrínseca central. Los miembros de la familia antiapoptótica funcionan secuestrando moléculas de solo BH3 en complejos estables, evitando la activación de BAX y / o BAK o antagonizando directamente BAX y BAK. 20, 21, 22


Conclusión

Uno de los mayores desafíos de la medicina moderna es la comprensión de la DCP en el contexto del cáncer y las enfermedades autoinmunes, cardiovasculares y neurodegenerativas. La evidencia acumulada apunta hacia la conservación filogenética de la maquinaria central y los reguladores centrales de la muerte celular entre levaduras y mamíferos. Esto ha abierto la posibilidad de utilizar la levadura como una herramienta de investigación que puede proporcionar nuevas pistas en la elucidación de las vías de muerte celular en eucariotas superiores. De hecho, el modelo apoptótico de levadura ya ha demostrado su potencial de aplicación en el sistema humano, como lo demuestra el creciente número de estudios que utilizan levadura como modelo de neurotoxicidad y cáncer. 47, 88 Es importante destacar que varias contrapartes de los factores de muerte de las células de levadura en mamíferos desempeñan funciones importantes en la patogenia de la enfermedad. Entre ellas se encuentran las caspasas, involucradas en muchos estados fisiológicos y patológicos AIF, cuya ausencia puede ocasionar neurodegeneración, atrofia del músculo esquelético y miocardiopatía dilatada o endonucleasa-G, cuya translocación nuclear se ha asociado con isquemia cerebral y atrofia muscular. La levadura también sirve como modelo para el envejecimiento de las células posmitóticas (envejecimiento cronológico) y de las células madre (envejecimiento replicativo), y ha arrojado luz sobre la posibilidad de combatir patógenos unicelulares de hongos o protozoos mediante la inducción farmacológica de PCD. Es de destacar que la levadura representa un eucariota con mitocondrias fácilmente manipulables, que están emergiendo como orgánulos centrales en la regulación de la apoptosis.


Después de la inducción del daño del ADN, una ruta importante de inactivación celular es la apoptosis. Durante los últimos diez años se han identificado lesiones específicas del ADN que desencadenan la apoptosis. Estos incluyen O6-metilguanina, N-alquilaciones de bases, aductos voluminosos de ADN, enlaces cruzados de ADN y roturas de doble cadena de ADN (DSB). La reparación de estas lesiones es importante para prevenir la apoptosis. Una excepción son las lesiones de O6-metilguanina-timina, que requieren reparación de desajustes para desencadenar la apoptosis. La apoptosis inducida por muchas genotoxinas químicas es la consecuencia del bloqueo de la replicación del ADN, lo que conduce al colapso de las horquillas de replicación y a la formación de DSB. Se cree que estos DSB son lesiones cruciales que desencadenan la apoptosis aguas abajo. Los DSB son detectados por las proteínas ATM (ataxia telangiectasia mutada) y ATR (ataxia telangiectasia y relacionadas con Rad3), que señalan aguas abajo a CHK1, CHK2 (punto de control quinasas) y p53. p53 induce la activación transcripcional de factores proapoptóticos como FAS, PUMA y BAX. Muchos tumores albergan mutaciones en p53. Hay sistemas de respaldo p53 que involucran la activación de E2F1 impulsada por CHK1 y / o CHK2 y la regulación al alza de p73, que a su vez transcribe BAX, PUMA y NOXA. Otro desencadenante de la apoptosis tras el daño del ADN es la inhibición de la síntesis de ARN, que conduce a una disminución en el nivel de productos genéticos críticos como MKP1 (proteína quinasa fosfatasa activada por mitógenos). Esto provoca una activación sostenida de JNK (Jun quinasa) y, finalmente, AP-1, que estimula la activación del receptor de muerte. La señalización desencadenada por daño del ADN y la ejecución de la apoptosis es específica del tipo de célula y de la genotoxina dependiendo del estado de p53 (p63 y p73), la capacidad de respuesta del receptor de muerte, la activación de la MAP-quinasa y, lo más importante, la capacidad de reparación del ADN. Debido a que la mayoría de los medicamentos clínicos contra el cáncer se dirigen al ADN, se espera que el aumento de los conocimientos sobre la señalización desencadenada por daños en el ADN que conduce a la muerte celular proporcione nuevas estrategias para las intervenciones terapéuticas.

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RESULTADOS

La expresión adenoviral de FADD-DD causa apoptosis de células epiteliales prostáticas normales

Nuestros experimentos anteriores que mostraban que FADD-DD podía inducir la apoptosis de las células epiteliales de la próstata se realizaron mediante microinyección de plásmidos de expresión de FADD-DD (Morgan et al., 2001). Para excluir la posibilidad remota de que la apoptosis dependiera del método de entrega de FADD-DD y para permitir el uso de ensayos bioquímicos, construimos adenovirus regulados por Dox que expresan FADD-DD marcado con YFP o un control de YFP. La coinfección de estos virus con un virus represor de Tet da como resultado una represión eficaz en presencia de Dox y expresión cuando se elimina Dox. La Figura 1 muestra la expresión de YFP y YFP-FADD-DD en células epiteliales de próstata primarias normales o la línea celular de tumor epitelial de próstata DU145. La expresión fue estrictamente regulada por Dox como lo demuestran las imágenes de fluorescencia y la transferencia Western. FADD-DD pero no el control de YFP causó la muerte de las células normales (compare los paneles ayb con eyf). FADD-DD no destruyó las células tumorales (compare los paneles i y j con myn). La transferencia de Western muestra que tanto las células normales como las tumorales expresaron cantidades similares de YFP e YFP-FADD-DD. El adenovirus que expresa FADD-DD no destruyó los fibroblastos de próstata primarios normales ni otras líneas celulares de cáncer de próstata (LNCaP, PC3, CA-HPV7, datos no publicados). Estos datos amplían nuestros experimentos anteriores (Morgan et al., 2001) y demuestran que la diferencia en la respuesta entre las células epiteliales prostáticas normales y las células tumorales no se debe a diferencias en los niveles de expresión de FADD-DD en los diferentes tipos de células.

Fig. 1. FADD-DD destruye selectivamente las células epiteliales prostáticas normales. Se infectaron células epiteliales de próstata primarias normales o células tumorales DU145 con adenovirus regulados por Dox que expresan YFP (a, b, c, d, i, j, k, l) o FADD-DD marcado con YFP (e, f, g, h , m, n, o, p) y un virus TetR. Los paneles adyacentes muestran imágenes de fase y fluorescencia del mismo campo. La expresión se indujo eliminando Dox. FADD-DD provocó la muerte de las células normales (eyf) pero no afectó a las células DU145 (myn). YFP no tuvo ningún efecto en ninguno de los tipos de células. El panel inferior muestra la proteína total probada con anti-YFP. En cada caso se expresaron cantidades iguales de proteína. La banda superior es una proteína de reacción cruzada que sirve como control de carga.

FADD-DD inhibe la apoptosis inducida por Fas en células tumorales de próstata

La inducción de la apoptosis por FADD-DD fue un hallazgo inesperado porque esta molécula se ha utilizado ampliamente como inhibidor de la apoptosis inducida por el receptor de muerte. Por lo tanto, probamos si nuestra molécula FADD-DD podría inhibir la apoptosis inducida por Fas en células tumorales de próstata. Las células DU145 activan la caspasa 8 y sufren apoptosis cuando se estimulan con anticuerpos Agonistas Fas en presencia de cicloheximida (Rokhlinet al., 1998). Expresamos YFP o YFP-FADD-DD del adenovirus regulado y luego tratamos células DU145 con anti-Fas en presencia de cicloheximida. Las imágenes de fase y de fluorescencia del mismo campo se superpusieron para permitir el examen de la morfología de las células que expresan YFP o YFP-FADD-DD después de la activación de la señalización de Fas. La Figura 2A muestra que FADD-DD previno la muerte celular inducida por Fas, mientras que YFP no lo hizo. Las células moribundas mostraron características típicas de apoptosis con múltiples ampollas de membrana. La transferencia de Western para la aparición de la forma escindida de la caspasa 8 mostró que la expresión de FADD-DD impedía la activación de la caspasa 8 en respuesta a Fas (Figura 2B). Estos datos indican que nuestra molécula FADD-DD inhibe la señalización de apoptosis por receptores de muerte activados. Por lo tanto, la nueva capacidad proapoptótica de FADD-DD en células epiteliales de próstata normales se produce además de las funciones antiapoptóticas establecidas de esta molécula, que se producen en células tumorales de próstata.

Fig. 2. FADD-DD inhibe la apoptosis inducida por Fas en células tumorales de próstata. Se infectaron células DU145 con los adenovirus YFP o YFP-FADD-DD, se indujo la expresión eliminando Dox, y luego se trataron las células con un anticuerpo agonista anti-Fas. (A) Morfología celular que indica apoptosis inducida por Fas que es inhibida por YFP-FADD-DD pero no por YFP. (B) Muestras de proteína total sometidas a transferencia Western con anticaspasa 8. Fas estimula la caspasa 8 como lo indica la aparición de la banda de caspasa 8 procesada que es inhibida por YFP-FADD-DD.

FADD-DD activa caspasas en células epiteliales normales

Usamos células infectadas con adenovirus y transferencia Western para probar si las caspasas son activadas por FADD-DD. Primero, probamos si FADD-DD podría causar la aparición de epítopos dependientes de caspasa en proteínas endógenas. La citoqueratina 18 es escindida por caspasas efectoras (Caulin et al., 1997) durante la apoptosis de células epiteliales. Un neoepítopo dependiente de caspasa revelado por la escisión de la citoqueratina 18 en Asp398 es reconocido por el anticuerpo M30 (Bantel et al., 2000). El anticuerpo reconoce dos fragmentos de ∼45 y 21 kDa, dependiendo de si también se escinde un segundo sitio de caspasa en Asp 237 (Bantel et al., 2000). Para probar si la expresión de FADD-DD condujo a la escisión de la citoqueratina 18, expresamos YFP o YFP-FADD-DD de los adenovirus regulados, recolectamos las células y probamos una transferencia Western con el anticuerpo M30. La Figura 3A muestra que FADD-DD y el control positivo (tratamiento con sorbitol para inducir la apoptosis inducida por estrés hiperosmolar) provocaron la aparición del neoepítopo de 45 kDa, mientras que la expresión de YFP no lo hizo. El sorbitol también provocó la aparición de la banda de 21 kDa. También detectamos PARP escindida por caspasa en respuesta a FADD-DD y sorbitol. Las proteínas escindidas no estaban presentes cuando las células que expresaban FADD-DD se trataron con el inhibidor de caspasa zVAD.fmk. Estos datos indican que las caspasas efectoras activas son inducidas por FADD-DD en células de próstata normales.

Fig. 3. Activación de caspasa por FADD-DD. Se infectaron células epiteliales de próstata normales con adenovirus YFP o YFP-FADD-DD o se trataron con sorbitol 300 mM como control. Las células se recogieron y los extractos de proteínas totales se separaron en geles y se sometieron a transferencia Western con los anticuerpos indicados. El panel A muestra que FADD-DD provoca la aparición de formas escindidas de citoqueratina 18 y PARP que son bloqueadas por el tratamiento con zVAD.fmk. El panel B muestra que las formas activas de caspasa 9, 7, 3 y 6, pero no la caspasa 8, son inducidas por FADD-DD.

A continuación, preguntamos qué caspasas se activaron después de la expresión de YFP o YFP-FADD-DD (Figura 3B). Como control positivo para asegurar que los anticuerpos funcionaran, usamos células tratadas con sorbitol. A diferencia de las otras caspasas, donde la escisión es necesaria y suficiente para la activación, la caspasa 9 no requiere procesamiento para la activación (Renatus et al., 2001). Sin embargo, la caspasa 9 activa se digiere a sí misma cuando es activada por dimerización (Renatus et al., 2001). Por tanto, la presencia de caspasa 9 escindida indica actividad de caspasa 9. El tratamiento con sorbitol y la expresión de FADD-DD causaron la aparición de formas activas de caspasa 9, caspasa 7 y caspasa 3. Se detectó caspasa 6 activa en células que expresan FADD-DD pero no en las células tratadas con sorbitol. El sorbitol y el FADD-DD condujeron a niveles similares de escisión de la caspasa 9, pero el sorbitol fue más eficaz para activar la caspasa 3 y la caspasa 7 que el FADD-DD. No pudimos detectar la activación de la caspasa 8 por FADD-DD, sin embargo, el sorbitol fue eficaz para activar la caspasa 8. La activación de la caspasa 8 por el sorbitol probablemente contribuye al aumento de la actividad de las caspasa 3 y 7 en comparación con FADD-DD. zVAD.fmk inhibió la aparición de formas escindidas de las caspasas en las células que expresan FADD-DD, lo que sugiere que las caspasas efectoras se activan como resultado de la activación de las caspasas iniciadoras (es decir, caspasa 9) y que la caspasa 9 activada se digiere a sí misma. Estos datos sugieren que FADD-DD estimula la vía intrínseca en las células prostáticas normales para activar la caspasa 9 y las caspasas efectoras aguas abajo. FADD-DD no activa la caspasa 8, que generalmente es activada por receptores de muerte. Esto no es sorprendente porque FADD-DD carece del dominio efector de muerte que se requiere para la activación de la caspasa 8.

Las caspasas y las serina proteasas contribuyen a la apoptosis inducida por FADD-DD

A pesar del hecho de que las caspasas son activadas por FADD-DD, previamente encontramos que los inhibidores de caspasas no podían prevenir la muerte de células epiteliales de próstata inducida por FADD-DD (Morgan et al., 2001). Por lo tanto, probamos si otras proteasas podrían estar involucradas en esta respuesta. Varios estudios indican un papel de las serina proteasas en la apoptosis (Johnson, 2000 Leist y Jaattela, 2001a). Además, algunas proteínas como el supresor de tumores Bin1 inducen apoptosis que puede ser bloqueada por inhibidores de serina proteasa como AEBSF pero no por inhibidores de caspasa (Elliott et al., 2000). Para probar si un inhibidor de la serina proteasa podría prevenir la apoptosis inducida por FADD-DD, inyectamos células epiteliales de próstata normales con plásmidos de expresión de FADD-DD, luego tratamos las células con zVAD.fmk o AEBSF y monitoreamos la supervivencia celular determinando el destino de cada FADD-DD –Expresando celda.

La Figura 4 muestra que ni zVAD.fmk ni AEBSF podrían prevenir la muerte celular cuando se agregan por sí solos. Sin embargo, cuando tratamos las células que expresan FADD-DD con ambos inhibidores simultáneamente, sobrevivieron. Algunas de las células YFP de control se sometieron a división celular, lo que resultó en una supervivencia aparente de & gt100%, mientras que las células que expresan FADD-DD no se elevaron por encima del 100% incluso en presencia de ambos inhibidores. Esto puede reflejar un efecto separado de los inhibidores de proteasa o de la inhibición del crecimiento celular de FADD-DD. Debido a que tanto el inhibidor de caspasa como el inhibidor de serina proteasa son necesarios para prevenir la muerte celular, estos datos sugieren que FADD-DD activa señales separadas de caspasa y serina proteasa y que una enzima no está aguas arriba de la otra. Además, si se bloquea una señal, la otra proteasa es suficiente para matar las células. Debido a que se ha informado que zVAD.fmk puede inhibir la catepsina B (Schotte et al., 1999), probamos si un inhibidor específico de la catepsina B (CA-074-ME) podría cooperar con AEBSF para prevenir la muerte celular inducida por FADD-DD. El inhibidor de la catepsina B no imitó el efecto de zVAD.fmk (datos no publicados), lo que indica que las propias caspasas son importantes en la respuesta.

Fig. 4. Las caspasas y las serina proteasas contribuyen a la apoptosis inducida por FADD-DD. Se inyectaron células de próstata normales con el control YFP de los plásmidos de expresión YFP-FADD-DD como se indica y luego se trataron con el inhibidor de caspasa (zVAD.fmk, 0,1 mM) o inhibidor de serina proteasa (AEBSF, 0,3 mM) como se indica. El porcentaje de células inyectadas que sobreviven se determinó después de 24 h de incubación, lo que indica que ni zVAD.fmk ni AEBSF por sí solos pudieron prevenir la muerte celular inducida por FADD-DD, pero la combinación de ambos inhibidores previno la muerte. Los datos mostrados son medias ± SEM de cinco experimentos separados.

Las caspasas y las serina proteasas tienen diferentes efectos sobre la morfología de las células moribundas

Hay ejemplos en la literatura donde otras proteasas y caspasas inducen fenotipos apoptóticos similares, presumiblemente al escindir los mismos sustratos (Foghsgaard et al., 2001). También hay ejemplos en los que los fenotipos de las células que mueren en respuesta a estímulos que pueden activar tanto las caspasas como otras señales de muerte son bastante diferentes (McCarthy et al., 1997). Para determinar si las células epiteliales de próstata normales que mueren en respuesta a FADD-DD utilizan señales dependientes de caspasa y serina proteasa para matar células de diferentes maneras, utilizamos microscopía de lapso de tiempo. La Figura 5 muestra fotogramas de series de lapso de tiempo de células prostáticas normales inyectadas con FADD-DD en ausencia o presencia de zVAD.fmk y AEBSF. Las imágenes de fluorescencia se superponen a la imagen de fase. La figura muestra las mismas células en el punto de tiempo inicial y en el punto de tiempo final (6-7 h para las células de control, zVAD.fmk y tratadas con AEBSF y 15 h para las células tratadas con zVAD.fmk + AEBSF). Las células verdes expresan FADD-DD. Las películas Quicktime de este experimento se incluyen en el material complementario. Sin inhibidores, las células que expresan FADD-DD se contraen y muestran numerosas ampollas de membrana (flechas) que retienen la proteína fluorescente como es típico de la apoptosis dependiente de caspasa. En presencia de zVAD.fmk, las células moribundas se contraen, se redondean y se desprenden del plato, pero no muestran ampollas en la membrana. Por el contrario, las células inyectadas con FADD-DD que mueren en presencia de AEBSF sin zVAD.fmk muestran las características típicas de la actividad de la caspasa, como las ampollas de membrana. De acuerdo con los datos de supervivencia celular que se muestran en la Figura 4, la mayoría de las células que expresan FADD-DD en presencia de zVAD.fmk y AEBSF permanecen planas y unidas a la placa. Por tanto, las caspasas que son activadas por FADD-DD en las células epiteliales normales causan las distintas ampollas de membrana que son características de las células moribundas.

Fig. 5. Las caspasas y las serina proteasas regulan diferentes aspectos de la apoptosis inducida por FADD-DD. Se inyectaron células de próstata normales con el plásmido de expresión YFP-FADD-DD y luego se incubaron con zVAD.fmk o AEBSF como se indica. Se realizó microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo para controlar la respuesta de cada célula inyectada. Las imágenes muestran imágenes de fase y fluorescencia superpuestas de las mismas células al principio y al final del experimento, lo que indica que FADD-DD causa ampollas en la membrana y fragmentación celular que es bloqueada por zVAD.fmk pero no por AEBSF. Las películas Quicktime de estos experimentos se incluyen en el material complementario.

Bcl-xL inhibe los fenotipos dependientes de caspasa en la apoptosis inducida por FADD-DD

Bcl-xL bloquea la liberación del citocromo cy otras proteínas mitocondriales. Examinamos la morfología de las células que coexpresaban FADD-DD y Bcl-xL. Bcl-xL evitó la formación de ampollas en la membrana pero no evitó el redondeo celular (Figura 6A). Esto sugiere que Bcl-xL inhibió la activación de caspasa pero no la serina proteasa que es inhibida por AEBSF. Se observó una inhibición similar de la formación de ampollas cuando coexpresamos FADD-DD con una versión dominante negativa de caspasa 9 (dn9), que tiene una mutación cisteína-serina en el sitio activo. Estos datos sugieren que FADD-DD activa la caspasa 9 a través de la vía mitocondrial y Bcl-xL debería inhibir las caspasas inducidas por FADD-DD. Probamos esta hipótesis midiendo directamente la actividad de caspasa en células que fueron inyectadas con FADD-DD usando un método basado en FRET (Morgan y Thorburn, 2001). El método permite la medición continua de la actividad de caspasa en células individuales. Monitoreamos los cambios en la actividad de la caspasa durante 120 min antes del comienzo de la contracción celular y el redondeo en las células que expresan FADD-DD en presencia o ausencia de Bcl-xL. Esto se logra monitoreando los cambios en la proporción de fluorescencia amarilla (FRET) / fluorescencia cian emitida por una fusión CFP-YFP que puede ser escindida por la caspasa 3 y otras caspasas efectoras. La Figura 6B muestra la actividad de caspasa en siete células que expresan FADD-DD– y siete FADD-DD + Bcl-xL. FADD-DD provoca la activación de una caspasa que puede escindir la sonda FRET. Esto se muestra por un aumento en la actividad de caspasa medida por una pérdida de FRET y un aumento en la fluorescencia cian que resulta en un cambio en la relación amarillo / cian.

Fig. 6. Bcl-xL inhibe la activación de caspasas por FADD-DD. Las células que expresan FADD-DD se coinyectaron con plásmidos de expresión de control, Bcl-xL y caspasa 9 (dn9) dominante negativa. El panel A muestra la morfología de las células inyectadas. Bcl-xL y dn9 inhiben la formación de ampollas en la membrana que se observa típicamente con FADD-DD solo. Las imágenes son imágenes de fase y fluorescencia superpuestas, las células verdes expresan la molécula FADD-DD etiquetada con YFP. El panel B muestra la activación de caspasa en siete células inyectadas con FADD-DD (líneas rojas) y siete células inyectadas con FADD-DD más Bcl-xL (líneas azules) junto con el plásmido de expresión que codifica la sonda FRET de color amarillo cian. Se capturaron imágenes de fluorescencia para la fluorescencia amarilla y cian, y se calculó la relación de fluorescencia amarillo / cian por unidad de área para cada punto de tiempo. El cambio inverso en la proporción de FRET indicativo de la activación de caspasa se representó gráficamente después de la normalización para cada célula. La cuantificación se realizó durante 120 minutos antes de que comenzara la contracción celular y el redondeo (tiempo designado 0). FADD-DD provoca un aumento abrupto de la actividad de la caspasa que es impedido por Bcl-xL. El panel C muestra la supervivencia celular de células inyectadas con FADD-DD, células inyectadas con FADD-DD más Bcl-xL o células inyectadas con FADD-DD más caspasa dominante negativa 9 (dn9) en presencia o ausencia de AEBSF (AE) o zVAD .fmk (zVAD) donde se indique. FADD-DD induce la muerte celular que no puede ser bloqueada por AEBSF, zVAD, Bcl-xL o dn9 solos. Bcl-xL y zVAD.fmk no cooperan para prevenir la muerte inducida por FADD-DD. Tanto Bcl-xL como la caspasa 9 dominante negativa cooperan con AEBSF para inhibir la muerte celular inducida por FADD-DD, lo que da como resultado una supervivencia celular similar a la del control YFP. Los datos son medias ± SEM de entre 4 y 12 experimentos para cada muestra.

El aumento en la actividad de la caspasa comienza abruptamente 30 a 60 min antes de que cada célula comience a contraerse, lo que se designó como tiempo 0. Bcl-xL inhibió esta activación de caspasa y no hubo un aumento detectable en la actividad de la caspasa en ninguno de los Bcl-xL que expresan células. Sin embargo, tenga en cuenta que, al igual que las células FADD-DD solas, cada una de las células que expresan Bcl-xL sufrió contracción y redondeo celular, comenzando en el punto de tiempo designado como 0 min. Es de suponer que las caspasas se activan poco después de la liberación del citocromo c, que Green y sus colegas han demostrado que es rápido y coordinado dentro de cada célula (Goldstein et al., 2000). Juntos, estos datos sugieren que la activación de la caspasa ocurre a través de la vía mitocondrial y que la serina proteasa que es inhibida por AEBSF se activa a través de un mecanismo diferente. Si esto es correcto, Bcl-xL o caspasa 9 dominante negativa no deberían inhibir la muerte celular inducida por FADD-DD por sí mismos, sino que deberían cooperar con AEBSF para prevenir la muerte celular. Por el contrario, Bcl-xL no debería cooperar con zVAD.fmk para inhibir la muerte inducida por FADD-DD. La Figura 6C muestra que este es realmente el caso. La muerte celular se bloqueó eficazmente sólo mediante la combinación de AEBSF con Bcl-xL o caspasa 9 dominante negativa.

La FADD de longitud completa induce la apoptosis a través de un mecanismo independiente de la caspasa 8 en células prostáticas normales pero no cancerosas

Los experimentos anteriores se realizaron utilizando la molécula FADD-DD truncada. La expresión de FADD de longitud completa de tipo salvaje induce apoptosis en todas las células en virtud de su capacidad para activar la caspasa 8. Para probar si la misma vía podría activarse por FADD de longitud completa en lugar de solo la molécula truncada, primero identificamos el punto FADD mutantes que no pueden unirse a la caspasa 8 utilizando una pantalla inversa de dos híbridos (Thomas et al., 2002). Las pantallas inversas de dos híbridos identifican mutantes que han perdido la capacidad de interactuar con una proteína en particular. Nuestro método modificado requiere que estos mutantes retengan la capacidad de interactuar con una proteína diferente y, por lo tanto, selecciona mutantes que pierden interacciones de unión específicas sin afectar la estructura o estabilidad general de la proteína. Examinamos & gt500.000 mutantes aleatorios de FADD e identificamos mutantes que conservaban la capacidad de interactuar con Fas pero que no podían interactuar con la caspasa 8. Todas las mutaciones estaban en el dominio efector de muerte de la proteína. Se eligieron tres mutantes (L8P, S12L y L15P) para un análisis adicional. Los tres mutantes se unieron a Fas pero no a la caspasa 8. Los mutantes L8P y L15P también mostraron unión de tipo salvaje a TRADD (Figura 7A). Los mutantes se prepararon como fusiones de GFP y se inyectaron en células de próstata normales o células tumorales DU145. Si la apoptosis dependiente de FADD en células normales es distinta del mecanismo de acción establecido de FADD a través de la caspasa 8, estos mutantes deberían comportarse como FADD-DD y matar las células de próstata normales pero no las células tumorales de próstata. La Figura 7B muestra que este fue el caso.

Fig. 7. La FADD de longitud completa destruye las células prostáticas normales mediante un mecanismo independiente de la caspasa 8. (A) Ensayos de filtro de β-galactosidasa de levadura de interacciones directas de dos híbridos de mutantes de FADD de longitud completa que se seleccionaron mediante un cribado inverso de dos híbridos para determinar si no interactuaban con la caspasa 8 mientras se conservaba la capacidad de interactuar con Fas. Los mutantes FADD L8P y L15P se unieron tanto a TRADD como a Fas pero no a la caspasa 8. El mutante S12L no se unió a la caspasa 8 ni a TRADD. Los controles muestran ensayos de β-Gal de levadura que expresa el vector vacío y la unión de FADD de tipo salvaje a la caspasa 8. (B) Ensayos de supervivencia celular después de la microinyección de YFP, FADD-DD o los mutantes FADD de longitud completa L8P, S12L y L15P en células de próstata normales y células de cáncer de próstata DU145. FADD-DD y los tres mutantes FADD de longitud completa mataron a las células normales pero no a las células DU145. (C) Supervivencia celular después de la microinyección de YFP o FADD de tipo salvaje en células de próstata normales o células DU145. La FADD de tipo salvaje mató tanto a las células normales como a las cancerosas. La coexpresión de caspasa 8 negativa dominante (dn8) o el pretratamiento con un inhibidor de caspasa 8 (zIETD) inhibió la muerte inducida por FADD en células DU145 pero no en células de próstata normales. Estos datos indican que la FADD puede destruir las células prostáticas normales en un mecanismo independiente de la caspasa 8 que no está activo en las células DU145.

Aunque los mutantes puntuales de FADD y el dominio de muerte de FADD aislado solo pueden destruir células epiteliales normales, la proteína de tipo salvaje puede inducir apoptosis tanto en células normales como cancerosas. A continuación, probamos si esta muerte fue inhibida por inhibidores de caspasa 8.La coexpresión de GFP-FADD de tipo salvaje de longitud completa con caspasa 8 dominante negativa o el tratamiento con un inhibidor selectivo de caspasa 8 (zIETD.fmk) inhibió la apoptosis de las células de cáncer de próstata pero no inhibió la apoptosis de las células de próstata normales (Figura 7C) . Estos datos indican que FADD puede activar dos vías de apoptosis en las células epiteliales de la próstata. La primera vía implica el reclutamiento de caspasa 8 a través del dominio efector de muerte y funciona tanto en las células de cáncer de próstata como en las células de próstata normales. La segunda vía funciona a través del dominio de muerte FADD, no involucra a la caspasa 8 y solo funciona en células normales.

La apoptosis de células prostáticas normales inducida por TRAIL se produce a través de vías dependientes de la caspasa y la serina proteasa

Los experimentos anteriores se realizaron utilizando moléculas FADD expresadas exógenamente. Sin embargo, no hay razón para pensar que la señalización de FADD en respuesta a señales fisiológicas esté mediada por la regulación de los niveles de expresión de FADD. Más bien, FADD es activado por receptores de muerte como Fas, TNFR1 o los receptores TRAIL, y el FADD sobreexpresado imita los efectos que ocurren en respuesta a la señalización del receptor, p. Ej., Activando la caspasa 8. En la mayoría de los casos, apoptosis después de la activación de estos receptores es inhibido por inhibidores de caspasa como zVAD.fmk. Sin embargo, hay ejemplos en los que estos receptores inducen apoptosis independiente de caspasa (Foghsgaard et al., 2001) y necrosis (Vercammen et al., 1998a, 1998b Denecker et al., 2001).

Si los receptores de muerte activan la vía de apoptosis dependiente de FADD-DD, deberíamos encontrar que la apoptosis de células prostáticas normales inducida por el ligando relevante no sería completamente inhibida por zVAD.fmk solo, sino que mostraría una mayor inhibición por zVAD.fmk más AEBSF. Por el contrario, las células tumorales de próstata deberían ser incapaces de activar la vía independiente de la caspasa 8 y, por lo tanto, deberían estar protegidas al máximo por zVAD.fmk solo. El TNF-α no mató eficazmente las células prostáticas normales (datos no publicados), pero tanto el ligando Fas como la apoptosis inducida por TRAIL de las células prostáticas normales. Se ha informado que TRAIL es incapaz de matar las células humanas normales, incluidas las células epiteliales prostáticas normales (Ashkenazi et al., 1999 Walczak et al., 1999). Sin embargo, otros investigadores han descubierto que TRAIL puede inducir la apoptosis de las células epiteliales prostáticas normales (Nesterov et al., 2002), apoyando así nuestras observaciones.

La muerte de células prostáticas normales inducida por TRAIL fue inhibida solo parcialmente por zVAD.fmk como se muestra por la presencia de muchas células redondeadas y desprendidas, pero fue bloqueada por zVAD.fmk más AEBSF (Figura 8). AEBSF solo no previno la muerte celular inducida por TRAIL. El inhibidor de caspasa previno la formación de ampollas en la membrana porque el tratamiento con TRAIL en presencia de zVAD.fmk dio como resultado muchas células redondeadas sin ampollas perceptibles. Los tratamientos TRAIL solo y TRAIL más AEBSF dieron como resultado muchas células con notorias ampollas en la membrana. La implicación de una actividad que es inhibida por AEBSF fue específica de las células normales porque zVAD.fmk inhibió completamente la muerte inducida por TRAIL de las células DU145. La adición de AEBSF no confiere protección adicional a las células DU145. Estos datos sugieren que TRAIL puede activar la vía de apoptosis convencional dependiente de la caspasa 8 y la vía que involucra señales sensibles a la caspasa y AEBSF en las células normales de la próstata, pero solo puede activar la vía de la caspasa 8 en las células cancerosas.

Fig. 8. TRAIL induce la apoptosis de células prostáticas normales pero no cancerosas a través de una actividad sensible a AEBSF. Se trataron células epiteliales de próstata normales y células de cáncer de próstata DU145 con cicloheximida sola (control) o cicloheximida más TRAIL recombinante en presencia de zVAD.fmk o AEBSF como se indica. La supervivencia celular se determinó mediante microscopía después de 24 h. TRAIL mató a las células prostáticas normales y cancerosas. El inhibidor de caspasa zVAD.fmk previno eficazmente la muerte celular en las células DU145 pero no previno la muerte en las células prostáticas normales. La adición de AEBSF y zVAD.fmk previno la muerte de las células normales. Estos datos indican que TRAIL activa las vías de muerte celular en las células prostáticas normales que tienen el mismo requisito para las señales dependientes de la caspasa y la serina proteasa que FADD-DD.


Contenido

La transición epitelial-mesenquimal fue reconocida por primera vez como una característica de la embriogénesis por Betty Hay en la década de 1980. [1] [2] La EMT y su proceso inverso, MET (transición mesenquimatosa-epitelial) son fundamentales para el desarrollo de muchos tejidos y órganos en el embrión en desarrollo, y numerosos eventos embrionarios como gastrulación, formación de crestas neurales, formación de válvulas cardíacas, desarrollo secundario del paladar y miogénesis. [3] Las células epiteliales y mesenquimales difieren tanto en el fenotipo como en la función, aunque ambas comparten una plasticidad inherente. [2] Las células epiteliales están estrechamente conectadas entre sí por uniones estrechas, uniones gap y uniones adherentes, tienen una polaridad apico-basal, polarización del citoesqueleto de actina y están unidas por una lámina basal en su superficie basal. Las células mesenquimales, por otro lado, carecen de esta polarización, tienen una morfología en forma de huso e interactúan entre sí solo a través de puntos focales. [4] Las células epiteliales expresan altos niveles de E-cadherina, mientras que las células mesenquimales expresan los de N-cadherina, fibronectina y vimentina. Por lo tanto, EMT implica profundos cambios morfológicos y fenotípicos en una célula. [5]

Según el contexto biológico, la EMT se ha categorizado en 3 tipos: desarrollo (tipo I), fibrosis [6] y cicatrización de heridas (tipo II) y cáncer (tipo III). [7] [8] [9]

La pérdida de E-cadherina se considera un evento fundamental en EMT. Muchos factores de transcripción (TF) que pueden reprimir E-cadherina directa o indirectamente pueden considerarse como EMT-TF (TF inductores de EMT). SNAI1 / Snail 1, SNAI2 / Snail 2 (también conocido como Slug), ZEB1, ZEB2, TCF3 y KLF8 (factor 8 similar a Kruppel) pueden unirse al promotor de E-cadherina y reprimir su transcripción, mientras que factores como Twist, Goosecoid , TCF4 (también conocida como E2.2), la proteína homeobox SIX1 y FOXC2 (proteína C2 de la caja de horquilla) reprimen la E-cadherina indirectamente. [10] [11] Los factores SNAIL y ZEB se unen a las secuencias consenso de la caja E en la región promotora, mientras que KLF8 se une al promotor a través de las cajas GT. Estos EMT-TF no solo reprimen directamente E-cadherina, sino que también reprimen transcripcionalmente otras proteínas de unión, incluidas las claudinas y los desmosomas, lo que facilita la EMT. Por otro lado, los factores de transcripción como el homólogo de la proteína tipo cabeza granulada 2 (GRHL2) y los factores de transcripción relacionados con ETS ELF3 y ELF5 se regulan negativamente durante la EMT y se encuentra que impulsan activamente MET cuando se sobreexpresan en células mesenquimales. [12] [13] Dado que la EMT en la progresión del cáncer recaptura a la EMT en los programas de desarrollo, muchos de los EMT-TF están involucrados en la promoción de eventos metastásicos. [14] [15]

Varias vías de señalización (TGF-β, FGF, EGF, HGF, Wnt / beta-catenina y Notch) y la hipoxia pueden inducir EMT. [7] [16] [17] En particular, se ha demostrado que Ras-MAPK activa Snail y Slug. [18] [19] [20] Slug desencadena los pasos de disrupción desmosómica, propagación celular y separación parcial en los bordes célula-célula, que comprenden la primera y necesaria fase del proceso EMT. Por otro lado, Slug no puede desencadenar la segunda fase, [21] que incluye la inducción de la motilidad celular, la represión de la expresión de citoqueratina y la activación de la expresión de vimentina. [22] Se sabe que Snail y Slug regulan la expresión de las isoformas p63, otro factor de transcripción necesario para el desarrollo adecuado de las estructuras epiteliales. [23] La expresión alterada de las isoformas de p63 redujo la adhesión célula-célula y aumentó las propiedades migratorias de las células cancerosas. El factor p63 está involucrado en la inhibición de la EMT y la reducción de ciertas isoformas de p63 puede ser importante en el desarrollo de cánceres epiteliales. [24] Se sabe que algunos de ellos regulan la expresión de citoqueratinas. [25] La fosfatidilinositol 3 'quinasa (PI3K) / eje AKT, la vía de señalización de Hedgehog, el factor nuclear-kappaB y el factor de transcripción activador 2 también se han implicado en la EMT. [26] [27] [28] [29]

La vía de señalización Wnt regula la EMT en la gastrulación, la formación de válvulas cardíacas y el cáncer. [30] La activación de la vía Wnt en las células de cáncer de mama induce al regulador EMT SNAIL y regula al alza el marcador mesenquimal, vimentina. Además, la vía activa de Wnt / beta-catenina se correlaciona con un mal pronóstico en pacientes con cáncer de mama en la clínica. De manera similar, TGF-β activa la expresión de CARACOL y ZEB para regular la EMT en el desarrollo cardíaco, la palatogénesis y el cáncer. La metástasis ósea del cáncer de mama ha activado la señalización de TGF-β, lo que contribuye a la formación de estas lesiones. [31] Sin embargo, por otro lado, p53, un conocido supresor de tumores, reprime la EMT activando la expresión de varios microARN, miR-200 y miR-34, que inhiben la producción de proteínas ZEB y CARACOL, y así mantienen la fenotipo epitelial. [32]

Después de la etapa inicial de la embriogénesis, la implantación del embrión y el inicio de la formación de la placenta están asociados con la EMT. Las células del trofoectodermo se someten a EMT para facilitar la invasión del endometrio y la colocación adecuada de la placenta, lo que permite el intercambio de nutrientes y gases con el embrión. Más adelante en la embriogénesis, durante la gastrulación, la EMT permite que las células ingresen en un área específica del embrión: la línea primitiva en los amniotas y el surco ventral en Drosophila. Las células de este tejido expresan E-cadherina y polaridad apical-basal. [33] Dado que la gastrulación es un proceso muy rápido, la E-cadherina es reprimida transcripcionalmente por Twist y SNAI1 (comúnmente llamado Caracol), y a nivel de proteína por la interacción de la proteína P38. La línea primitiva, a través de la invaginación, genera más mesoendodermo, que se separa para formar un mesodermo y un endodermo, nuevamente a través de EMT. Las células mesenquimales de la línea primitiva participan también en la formación de muchos órganos mesodérmicos epiteliales, como notocorda y somitas, a través del reverso de la EMT, es decir, la transición mesenquimatosa-epitelial. Amphioxus forma un tubo neural epitelial y notocorda dorsal, pero no tiene el potencial EMT de la línea primitiva. En los cordados superiores, el mesénquima se origina en la racha primitiva, migra hacia delante para formar los somitas y participar con el mesénquima de la cresta neural en la formación del mesodermo del corazón.

En los vertebrados, el epitelio y el mesénquima son los fenotipos básicos del tejido. Durante el desarrollo embrionario, las células de la cresta neural migratorias son generadas por EMT que involucra las células epiteliales del neuroectodermo. Como resultado, estas células se disocian de los pliegues neurales, ganan movilidad y se diseminan a varias partes del embrión, donde se diferencian a muchos otros tipos de células. Además, el mesénquima de la cresta craneofacial que forma el tejido conectivo que forma la cabeza y la cara, está formado por el epitelio del tubo neural por EMT. [34] La EMT tiene lugar durante la construcción de la columna vertebral a partir de la matriz extracelular, que será sintetizada por fibroblastos y osteoblastos que rodean el tubo neural. La fuente principal de estas células son el esclerotomo y el mesénquima somita, así como la raya primitiva. La morfología mesenquimatosa permite que las células viajen a objetivos específicos en el embrión, donde se diferencian y / o inducen la diferenciación de otras células. [34] [35]

Durante la cicatrización de la herida, los queratinocitos en el borde de la herida se someten a EMT y se someten a reepitelización o MET cuando la herida está cerrada. La expresión de Snail2 en el frente migratorio influye en este estado, ya que su sobreexpresión acelera la cicatrización de heridas. De manera similar, en cada ciclo menstrual, el epitelio de la superficie del ovario se somete a EMT durante la cicatrización de la herida post-ovulatoria. [36]

El inicio de la metástasis requiere invasión, que es habilitada por EMT. [37] [38] Las células de carcinoma en un tumor primario pierden la adhesión célula-célula mediada por la represión de E-cadherina y atraviesan la membrana basal con mayores propiedades invasivas, y entran al torrente sanguíneo a través de la intravasación. Más tarde, cuando estas células tumorales circulantes (CTC) salen del torrente sanguíneo para formar micro-metástasis, se someten a MET para el crecimiento clonal en estos sitios metastásicos. Por tanto, EMT y MET forman el inicio y la finalización de la cascada de invasión-metástasis. [39] En este nuevo sitio metastásico, el tumor puede sufrir otros procesos para optimizar el crecimiento. Por ejemplo, EMT se ha asociado con la expresión de PD-L1, particularmente en cáncer de pulmón. Los niveles elevados de PD-L1 inhiben el sistema inmunológico, lo que permite que el cáncer se propague más fácilmente. [40]

EMT confiere resistencia a la senescencia prematura inducida por oncogenes. Twist1 y Twist2, así como ZEB1, protegen las células humanas y los fibroblastos embrionarios de ratón de la senescencia. De manera similar, TGF-β puede promover la invasión tumoral y la evasión de la vigilancia inmunitaria en etapas avanzadas. Cuando TGF-β actúa sobre células epiteliales mamarias que expresan Ras activadas, se favorece la EMT y se inhibe la apoptosis. [41] Este efecto puede revertirse mediante inductores de diferenciación epitelial, como GATA-3. [42]

Se ha demostrado que la EMT es inducida por la terapia de privación de andrógenos en el cáncer de próstata metastásico. [14] La activación de los programas de EMT a través de la inhibición del eje de los andrógenos proporciona un mecanismo por el cual las células tumorales pueden adaptarse para promover la recurrencia y la progresión de la enfermedad. Brachyury, Axl, MEK y Aurora kinase A son impulsores moleculares de estos programas, y los inhibidores se encuentran actualmente en ensayos clínicos para determinar aplicaciones terapéuticas. [14] La PKC-iota oncogénica puede promover la invasión de células de melanoma activando Vimentina durante la EMT. La inhibición o desactivación de PKC-iota dio como resultado un aumento de los niveles de E-cadherina y RhoA, mientras que disminuyó la Vimentina total, Vimentina fosforilada (S39) y Par6 en células de melanoma metastásico. Estos resultados sugirieron que PKC-ι está involucrado en las vías de señalización que regulan positivamente la EMT en el melanoma. [43] [44]

Se ha indicado que EMT participa en la adquisición de resistencia a los medicamentos. Se encontró que la ganancia de marcadores EMT estaba asociada con la resistencia de las líneas de células epiteliales de carcinoma de ovario al paclitaxel. De manera similar, SNAIL también confiere resistencia a paclitaxel, adriamicina y radioterapia al inhibir la apoptosis mediada por p53. [45] Además, recientemente se demostró que la inflamación, que se ha asociado con la progresión del cáncer y la fibrosis, está relacionada con el cáncer a través de la EMT inducida por la inflamación. [46] En consecuencia, la EMT permite que las células adquieran un fenotipo migratorio, así como inducir inmunosupresión múltiple, resistencia a fármacos y mecanismos de evasión de apoptosis.

Alguna evidencia sugiere que las células que se someten a EMT adquieren propiedades similares a las de las células madre, lo que da lugar a células madre cancerosas (CSC). Tras la transfección por Ras activado, una subpoblación de células que exhiben los supuestos marcadores de células madre CD44high / CD24low aumenta con la inducción concomitante de EMT. [47] Además, ZEB1 es capaz de conferir propiedades similares a las de las células madre, fortaleciendo así la relación entre EMT y la madre. Por lo tanto, la EMT puede presentar un mayor peligro para los pacientes con cáncer, ya que la EMT no solo permite que las células del carcinoma ingresen al torrente sanguíneo, sino que también las dota de propiedades de tallo que aumentan el potencial tumorigénico y proliferativo. [48]

Sin embargo, estudios recientes han desplazado aún más los efectos primarios de la EMT desde la invasión y la metástasis hacia la resistencia a los agentes quimioterapéuticos. La investigación sobre el cáncer de mama y el cáncer de páncreas no demostró ninguna diferencia en el potencial metastásico de las células tras la adquisición de EMT. [49] [50] Estos están de acuerdo con otro estudio que muestra que el factor de transcripción EMT TWIST en realidad requiere uniones adherentes intactas para mediar la invasión local en el cáncer de mama. [51] Por lo tanto, los efectos de la EMT y su relación con la invasión y la metástasis pueden ser muy específicos del contexto.

En líneas celulares de carcinoma urotelial, la sobreexpresión de HDAC5 inhibe la proliferación a largo plazo, pero puede promover la transición epitelial a mesenquimal (EMT). [52]

Las plaquetas en la sangre tienen la capacidad de iniciar la inducción de EMT en las células cancerosas. Cuando las plaquetas se reclutan en un sitio en el vaso sanguíneo, pueden liberar una variedad de factores de crecimiento (PDGF, [53] VEGF, [54] Angiopoyetina-1 [55]) y citocinas, incluido el inductor de EMT TGF-β. [56] La liberación de TGF-β por las plaquetas en los vasos sanguíneos cerca de los tumores primarios aumenta la capacidad de invasión y promueve la metástasis de las células cancerosas en el tumor. [57] Los estudios que analizan plaquetas defectuosas y recuentos plaquetarios reducidos en modelos de ratón han demostrado que la función plaquetaria deficiente se asocia con una formación metastásica disminuida. [58] [59] En los seres humanos, el recuento de plaquetas y la trombocitosis dentro del límite superior del rango normal se relacionaron con cáncer de cuello uterino en estadio avanzado, a menudo metastásico, [60] cáncer de ovario, [61] cáncer gástrico, [62 ] y cáncer de esófago. [63] Aunque se ha aplicado una gran cantidad de investigación para estudiar las interacciones entre las células tumorales y las plaquetas, aún no se ha establecido una terapia contra el cáncer dirigida a esta interacción. [64] Esto puede deberse en parte a la redundancia de vías protrombóticas que requerirían el uso de múltiples enfoques terapéuticos para prevenir eventos pro-metastásicos a través de la inducción de EMT en células cancerosas por plaquetas activadas.

Para mejorar las posibilidades de que se desarrolle una metástasis de cáncer, una célula cancerosa debe evitar ser detectada y dirigida por el sistema inmunológico una vez que ingresa al torrente sanguíneo. Las plaquetas activadas tienen la capacidad de unirse a glicoproteínas y glicolípidos (ligandos de selectina P como PSGL-1) en la superficie de las células cancerosas para formar una barrera física que protege a la célula cancerosa de la lisis mediada por células asesinas naturales en el torrente sanguíneo. [65] Además, las plaquetas activadas promueven la adhesión de las células cancerosas a las células endoteliales activadas que recubren los vasos sanguíneos utilizando moléculas de adhesión presentes en las plaquetas. [66] [64] Los ligandos de P-selectina en la superficie de las células cancerosas aún no se han aclarado y pueden servir como posibles biomarcadores para la progresión de la enfermedad en el cáncer. [64]

Muchos estudios han propuesto que la inducción de EMT es el mecanismo principal por el cual las células cancerosas epiteliales adquieren fenotipos malignos que promueven la metástasis. [67] El desarrollo de fármacos dirigidos a la activación de EMT en células cancerosas se ha convertido, por tanto, en un objetivo de las empresas farmacéuticas. [68]

Inhibidores de moléculas pequeñas Editar

Se están desarrollando pequeñas moléculas que pueden inhibir la EMT inducida por TGF-β. [68] Silmitasertib (CX-4945) es un inhibidor de molécula pequeña de la proteína quinasa CK2, que se ha respaldado por estar relacionado con la EMT inducida por TGF-β, y actualmente se encuentra en ensayos clínicos para el colangiocarcinoma (cáncer de vías biliares), así como para en desarrollo preclínico para neoplasias hematológicas y linfoides. [69] [70] En enero de 2017, la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. Le otorgó el estatus de fármaco huérfano al silmitasertib para el colangiocarcinoma y actualmente se encuentra en un estudio de fase II. Silmitasertib está siendo desarrollado por Senhwa Biosciences.[71] Otro inhibidor de molécula pequeña, Galunisertib (LY2157299) es un potente inhibidor de la cinasa del receptor de TGF-β tipo I que se demostró que reduce el tamaño, la tasa de crecimiento de los tumores y el potencial de formación de tumores en líneas celulares de cáncer de mama triple negativo utilizando xenoinjertos. [72] Galunisertib está siendo desarrollado actualmente por Lilly Oncology y se encuentra en ensayos clínicos de fase I / II para el carcinoma hepatocelular, el cáncer de páncreas irresecable y el glioma maligno. [73] Se sugiere que los inhibidores de la EMT de moléculas pequeñas no reemplazan a los agentes quimioterapéuticos tradicionales, pero es probable que muestren la mayor eficacia en el tratamiento de cánceres cuando se usan junto con ellos.

Los antagonistas y los imitadores de microARN han ganado interés como una fuente potencial de terapias para atacar la metástasis inducida por EMT en el cáncer, así como para tratar muchas otras enfermedades. [74] Los antagonistas se desarrollaron por primera vez para dirigirse al miR-122, un microARN que era abundante y específico para el hígado, y este descubrimiento ha llevado al desarrollo de otros antagonistas que pueden emparejarse con microARN específicos presentes en el microambiente del tumor o en el cáncer. células. [75] [73] Se encontró que un microARN que imita a miR-655 suprime la EMT a través de la focalización del factor de transcripción inductor de EMT ZEB1 y del receptor 2 de TGF-β en una línea celular de cáncer de páncreas. La sobreexpresión del imitador de miR-655 en la línea celular de cáncer Panc1 aumentó la expresión de E-cadherina y suprimió la migración e invasión de células cancerosas de tipo mesenquimatoso. [76] El uso de imitadores de microARN para suprimir la EMT se ha expandido a otras líneas de células cancerosas y tiene potencial para el desarrollo de fármacos clínicos. [74] Sin embargo, los imitadores y antagonistas de microARN sufren de una falta de estabilidad en vivo y carecen de un sistema de administración preciso para dirigir estas moléculas a las células o tejidos tumorales para su tratamiento. [77] Las mejoras en antagomir y microARN imitan la estabilidad a través de modificaciones químicas como los oligonucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA) o los ácidos nucleicos peptídicos (PNA) pueden prevenir la rápida eliminación de estas pequeñas moléculas por las ARNasas. [77] [74] La administración de antagonistas y microARN imitadores en las células al encerrar estas moléculas en nanopartículas de liposomas ha generado interés, sin embargo, las estructuras de los liposomas adolecen de sus propios inconvenientes que deberán superarse para su uso eficaz como mecanismo de administración de fármacos. [77] Estos inconvenientes de las nanopartículas de liposomas incluyen la captación inespecífica por parte de las células y la inducción de respuestas inmunes. [78] El papel que juegan los microARN en el desarrollo del cáncer y la metástasis está bajo mucha investigación científica y aún no se ha demostrado si los imitadores o antagonistas de microARN pueden servir como tratamientos clínicos estándar para suprimir EMT o microARN oncogénicos en cánceres. [74]

Similar a la generación de células madre cancerosas, se demostró que la EMT genera células progenitoras endocrinas a partir de islotes pancreáticos humanos. [79] Inicialmente, se propuso que las células progenitoras derivadas de islotes humanos (hIPC) fueran mejores precursoras, ya que la progenie de células β en estas hIPC hereda marcas epigenéticas que definen una región promotora de insulina activa. [80] Sin embargo, más tarde, otro conjunto de experimentos sugirió que las células β marcadas se desdiferencian a un fenotipo similar al mesenquimatoso in vitro, pero no proliferan, iniciando así un debate en 2007. [81] [82] [83]

Dado que estos estudios en islotes humanos carecían de análisis de rastreo de linaje, estos hallazgos de células beta etiquetadas irreversiblemente en ratones se extrapolaron a islotes humanos. Por lo tanto, utilizando un sistema de rastreo de linaje lentiviral y genético dual para marcar las células β, se demostró de manera convincente que las células β de los islotes humanos adultos se someten a EMT y proliferan in vitro. [84] [85] Además, estos hallazgos se confirmaron en células productoras de insulina pancreática fetal humana, y las células mesenquimales derivadas de los islotes pancreáticos pueden experimentar lo contrario de EMT - MET - para generar agregados de células similares a islotes. [86] Por lo tanto, el concepto de generar progenitores a partir de células productoras de insulina mediante EMT o la generación de células madre cancerosas durante la EMT en el cáncer puede tener potencial para la terapia de reemplazo en la diabetes y requiere fármacos dirigidos a la inhibición de la EMT en el cáncer. [86]


Contenido

La citólisis ocurre cuando una célula estalla debido a un desequilibrio osmótico que ha provocado que el exceso de agua se mueva hacia la célula.

La citólisis se puede prevenir mediante varios mecanismos diferentes, incluida la vacuola contráctil que existe en algunos paramecios, que bombean agua rápidamente fuera de la célula. La citólisis no ocurre en condiciones normales en las células vegetales porque las células vegetales tienen una pared celular fuerte que contiene la presión osmótica, o presión de turgencia, que de otro modo causaría que ocurriera la citólisis.

La oncólisis es la destrucción de células neoplásicas o de un tumor.

El término también se usa para referirse a la reducción de cualquier hinchazón. [4]

La plasmólisis es la contracción de las células dentro de las plantas debido a la pérdida de agua por ósmosis. En un ambiente hipertónico, la membrana celular se desprende de la pared celular y la vacuola colapsa. Estas células eventualmente se marchitarán y morirán a menos que el flujo de agua causado por la ósmosis pueda detener la contracción de la membrana celular. [5]

La hemoglobina de los eritrocitos libera radicales libres en respuesta a los patógenos cuando son lisados ​​por ellos. Esto puede dañar a los patógenos. [6] [7]

La lisis celular se utiliza en laboratorios para romper células abiertas y purificar o estudiar más a fondo su contenido. La lisis en el laboratorio puede verse afectada por enzimas o detergentes u otros agentes caotrópicos. La rotura mecánica de las membranas celulares, como por congelación y descongelación repetidas, sonicación, presión o filtración, también puede denominarse lisis. Muchos experimentos de laboratorio son sensibles a la elección del mecanismo de lisis; a menudo es deseable evitar fuerzas de cizallamiento mecánicas que desnaturalizarían o degradarían macromoléculas sensibles, como proteínas y ADN, y diferentes tipos de detergentes pueden producir resultados diferentes. La solución sin procesar inmediatamente después de la lisis, pero antes de cualquier otro paso de extracción, a menudo se denomina lisado crudo. [8] [9]

Por ejemplo, la lisis se utiliza en transferencias Western y Southern para analizar la composición de proteínas, lípidos y ácidos nucleicos específicos de forma individual o como complejos. Dependiendo del detergente utilizado, se lisan todas o algunas membranas. Por ejemplo, si solo se lisa la membrana celular, entonces se puede usar la centrifugación en gradiente para recolectar ciertos orgánulos. La lisis también se utiliza para la purificación de proteínas, extracción de ADN y extracción de ARN. [8] [9]

Lisis química Editar

Este método utiliza disrupción química. Es el enfoque más popular y sencillo. La lisis química deteriora / solubiliza químicamente las proteínas y lípidos presentes dentro de la membrana de las células objetivo. [10]

Lisis acústica Editar

Este método utiliza ondas ultrasónicas para generar áreas de alta y baja presión que provocan cavitación y, a su vez, lisis celular. Aunque este método generalmente resulta limpio, no es rentable ni consistente. [11]

Lisis mecánica Editar

Este método utiliza la penetración física para perforar o cortar una membrana celular. [12]


Expresiones de gratitud

Los autores agradecen a los Dres. Sandra Healy y Sanjeev Gupta por sus sugerencias y comentarios sobre este manuscrito. El grupo de Fulda cuenta con el apoyo de subvenciones de Deutsche Forschungsgemeinschaft, Bundesministerium f & # x000fcr Bildung und Forschung, Deutsche Krebshilfe, la UE (ApopTrain, APO-SYS), Wilhelm Sander Stiftung, Else-Kr & # x000f6ner-the Novartis Stiftung f & # x000fcr therapeutische Forschung e IAP6 / 18. La investigación en los grupos de Samali y Gorman cuenta con el apoyo financiero de Science Foundation Ireland bajo las subvenciones núms. 09 / RFP / BMT2153, 09 / RFP / BIC2371 y 05 / IN3 / B851, así como subvenciones del Health Research Board of Ireland (HRA / 2009/59) y la Campaña contra el cáncer de mama.


Ver el vídeo: MUERTE CELULAR Apoptosis, necrosis y autofagia (Agosto 2022).