Información

F3. Enlace de hidrógeno - Biología


Linus Pauling sugirió por primera vez que los enlaces H (entre el agua y la proteína y dentro de la proteína misma) jugarían un papel dominante en el plegamiento y la estabilidad de las proteínas. ¿Recuerda todos los enlaces H intracadena en la hélice? ¿Son colectivamente más estables que los enlaces H entre el agua y el péptido en una espiral (aleatoria)?

Al pensar en estudios conformacionales que involucran péptidos pequeños, es útil aplicar el principio de Le Chatelier al equilibrio a continuación:

bobina aleatoria ( rightleftharpoons ) hélice

Cualquier elemento perturbador (moléculas pequeñas, disolvente, etc.) que interactúe preferentemente con la forma helicoidal empujaría el equilibrio a la forma helicoidal.

Los primeros modelos asumieron que los enlaces H intracadena eran energéticamente (entalpicamente) más favorables que los enlaces H entre péptido y agua. Pero para formar un enlace de hidrógeno se requiere una recuperación de la entropía, ya que una hélice está mucho más ordenada (entropía más baja) que una bobina aleatoria (entropía más alta). A baja temperatura predomina la entalpía y se favorece la formación de hélice en solución. A alta temperatura, la hélice se desfavorece entrópicamente. Imagínese el aumento de los estados vibracionales y rotacionales permitidos a los átomos a temperaturas más altas. (Recuerde los cambios conformacionales de trans a gauche en las cadenas de acilo de anfífilos de doble cadena a medida que aumenta la temperatura, lo que lleva a una transición de una fase de gel a cristalina líquida en vesículas de dos capas). Los estudios teóricos sobre las transiciones de hélice-espiral predicen lo siguiente:

  • a medida que aumenta la longitud de la cadena, la hélice se vuelve más estable;
  • el aumento de la carga en la molécula desestabiliza la hélice, ya que la bobina, en comparación con la hélice más compacta, tiene una densidad de carga más baja;
  • los disolventes que protonan el oxígeno del carbonilo (como el ácido fórmico) desestabilizan la hélice; y
  • los disolventes que forman fuertes enlaces H compiten con el péptido y desestabilizan la hélice. Por el contrario, los disolventes como el CHCl3 y la dimetilformamida (un disolvente no protótico) estabilizan la hélice. Asimismo, el 2-cloroetanol y el trifluoroetanol, que no forman enlaces H al péptido o son más débiles que el agua, estabilizan la hélice. (En el caso del trifluoroetanol, las simulaciones de dinámica molecular han demostrado que el TFE interactúa preferentemente con (solvata) el péptido, que inhibe los enlaces H de la cadena principal del péptido al agua, estabilizando los enlaces H intrahelicales.

Estos estudios de hélice-espiral sugieren que los enlaces H son importantes para estabilizar una proteína.

¿Pero realmente lo hacen? ¿Por qué estos enlaces H deberían diferir de los del agua? Es difícil saber si lo son, ya que existen muchos enlaces H posibles (entre proteína y agua, agua y agua, y proteína y proteína), y su fuerza depende de su orientación y de la constante dieléctrica del medio en el que se encuentran. situado.

Si los enlaces H intracadena en una proteína no son muy diferentes en energía que los enlaces H intermoleculares entre la proteína y el agua, y dado que las proteínas son marginalmente estables a temperaturas fisiológicas, entonces el estado plegado debe contener aproximadamente la misma cantidad de enlaces de hidrógeno intramoleculares. dentro de la proteína como posibles enlaces H intermoleculares entre la proteína y el agua, de lo contrario la proteína se desplegaría.

Para resolver este problema y determinar la fuerza relativa de los enlaces H entre los diferentes donantes y aceptores posibles, se han realizado muchos estudios para comparar la energía de los enlaces H entre moléculas pequeñas en el agua con la energía de los enlaces H entre las mismas moléculas pequeñas pero en un disolvente apolar. El razonamiento es el siguiente. Si el interior de una proteína es más no polar que el agua (constante dieléctrica más baja que el agua), entonces los enlaces H entre cadenas en una proteína podrían modelarse observando los enlaces H entre moléculas pequeñas en disolventes no polares y haciendo la pregunta, ¿es la energía libre? cambio para el siguiente proceso <0:

Dw + Aw ( rightleftharpoons ) (DA) n, DGo, K

donde D es un donante de enlace de hidrógeno (como NH) y A es un aceptor de enlace de hidrógeno, (como C = O), w es agua (es decir, el donante y el aceptor están en agua), yn es un disolvente no polar, y DGo y K son el cambio de energía libre estándar y la constante de equilibrio, respectivamente, para la formación de un enlace H en un disolvente no polar de un donante y un aceptor en agua. Esta reacción simula las contribuciones del enlace H al plegamiento de proteínas, donde un enlace H enterrado es imitado por un enlace H en un disolvente no polar. La reacción escrita anteriormente es realmente un experimento mental, ya que sería difícil establecer las condiciones necesarias para realizar la medición. Sin embargo, podemos calcular el DGo para esta reacción ya que es una función de estado y realmente no importa cómo se lleve a cabo este proceso.

Consideremos un ejemplo específico: la formación de enlaces H entre dos moléculas de N-metilacetamida (NMA) en agua y en un disolvente apolar. El esquema de reacción que se muestra a continuación describe un conjunto de reacciones (un ciclo termodinámico) que implican la formación de dímeros de NMA unidos a H. A y B son moléculas de NMA, ya sea en agua (w) o en un disolvente no polar (n).

La N-metilacetamida es un buen imitador de los donantes y aceptores del enlace H del enlace peptídico de una cadena polipeptídica.

En el esquema de reacción que se muestra arriba,

K1 es la constante de equilibrio para la dimerización de NMA en un medio no polar. Esto se puede determinar fácilmente y es> 1, lo que implica que DGo <0. (Recuerde, DGo = -RTlnKeq) Para la dimerización de NMA en CCl4, DGo1 = -2,4 kcal / mol.

K2 es la constante de equilibrio (piénselo como un coeficiente de partición) para la transferencia de dos moléculas de NMA del agua a un disolvente no polar (de nuevo, fácilmente medible). Para la transferencia de NMA del agua a CCl4, DGo2 = + 6,12 kcal / mol.

K3 es la constante de equilibrio para la dimerización de NMA en agua. Esto se puede determinar fácilmente y es <1, lo que implica que DGo> 0. Para la dimerización de NMA en agua, DGo3 = +3,1 kcal / mol.

K4 es la constante de equilibrio (considérelo como un coeficiente de partición) para la transferencia de un dímero de NMA unido a hidrógeno del agua a un disolvente no polar. ¡Intenta pensar en una forma de medir eso! No puedo. Aquí es donde los ciclos termodinámicos entran tan bien. No tienes que medirlo. ¡Puede calcularlo desde K1-3 ya que DGo es una función de estado!

[ Delta G ^ o_2 + Delta G ^ o_1 = Delta G ^ o_3 + Delta G ^ o_4 hspace {15px} textrm {o} hspace {15px} -RT ln K_2 + -RT ln K_1 = -RT ln K_3 + -RT ln K_4 ]

[ ln K_2 + ln K_1 = ln K_3 + ln K_4 = ln (K_2K_1) = ln (K_3K_4) hspace {15px} textrm {o} hspace {15px} (K_2K_1) = (K_3K_4 ) ]

Para la transferencia de NMA del agua a CCl4, D Go4 = + 0,62 kcal / mol.

(Nota: a los bioquímicos les gusta hablar sobre ciclos termodinámicos que pueden parecer nuevos para usted. Sin embargo, lo crea o no, los ha visto antes, en Química general, ¡en la forma de la Ley de Hess!)

A partir de K1-4 y los valores correspondientes de DGo, ahora podemos calcular DGo5 para la formación de dímeros NMA unidos a H en un disolvente no polar a partir de dos moléculas de NMA (aq). Esta reacción, que esperamos simule la formación de enlaces H intracatenarios enterrados en proteínas en el plegamiento de proteínas, es :,

Dw + Aw ( rightleftharpoons ) (DA) n, para el cual DGo5 = +3.72 (es decir, desfavorecido).

Si este modelo es un buen imitador para estudiar la formación de enlaces H en el plegamiento de proteínas, sugiere que la formación de enlaces H enterrados durante el plegamiento de proteínas no impulsa el plegamiento de proteínas.

Sin embargo, si la transferencia de D y A (de una proteína grande) del agua al medio no polar (modelado por K2) es impulsada por otras fuerzas (como el efecto hidrofóbico), el valor positivo de K1 favorecerá fuertemente el enlace H enterrado. formación. Entonces, si esto sucede en las proteínas, está claro por qué ocurren tantos enlaces H intracadena, ya que K1 es tan favorecido. Los enlaces H pueden no ayudar al colapso de una proteína, pero favorecerían la organización interna dentro de una proteína compacta. Es decir, los enlaces H no impulsan el plegamiento de proteínas per se, sino que se forman de modo que la proteína plegada no se desestabilice por demasiados enlaces H insatisfechos.

Existen problemas potenciales con este modelo simple. El interior de una proteína no es homogéneo (es decir, el dieléctrico eficaz dentro de la proteína variará). La fuerza de unión de H también es muy sensible a la geometría. Además, hay muchos enlaces H dentro de una proteína, por lo que pequeños errores en la estimación de la fuerza del enlace H conducirían a grandes errores en la determinación de la estabilidad de la proteína.

Otro argumento en contra de que los enlaces H sean el factor determinante en el plegamiento y la estabilidad de las proteínas proviene de estudios de desnaturalización con solventes. Si los enlaces de H intracatenarios son tan importantes, ¿no deberían los disolventes que pueden enlazar el H con la cadena principal desnaturalizar la proteína? ¿No debería el agua (55 M) actuar como desnaturalizante? Sin embargo, no es así. No se esperaría que el dioxano (anillo heterocíclico de 5 miembros con O) que solo tiene un aceptor de enlace H desnaturalice las proteínas, pero lo hace. Los enlaces H también aumentan en los disolventes no polares. Los péptidos que tienen estructuras aleatorias en el agua pueden inducirse a formar hélices cuando se colocan en soluciones alcohólicas (trifluoretanol, por ejemplo), que son más apolares que el agua, como se explicó anteriormente en los estudios de hélice-espiral. Si los enlaces H son el factor dominante en la estabilidad de las proteínas, los alcoholes estabilizarían las proteínas. A bajas concentraciones de alcohol, las proteínas se desestabilizan.

Por lo tanto, según los estudios de moléculas pequeñas y el estudio de proteínas en varios codisolventes, es poco probable que los enlaces H sean los grandes estabilizadores de la estructura de las proteínas. Solo el 11% de todos los C = O y el 12% de todos los NH en las proteínas no tienen enlaces H (determinado por análisis de estructuras cristalográficas de rayos X). De todos los enlaces de H a C = O, el 43% son al agua, el 11% a las cadenas laterales y el 46% a los NH de la cadena principal. De todos los enlaces de H a NH, el 21% son al agua, el 11% a las cadenas laterales y el 68% a la cadena principal C = O. Sin embargo, veremos más adelante que se llega a una conclusión opuesta a partir de estudios que utilizan mutagénesis de sitio específico.


Un no canónico FLT3 La mutación del guardián interrumpe la unión de gilteritinib y confiere resistencia.

Elie Traer, Universidad de Ciencias y Salud de Oregon, 3181 SW Sam Jackson Park Road, KR-HEM, Portland, OR 97239.

Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University, Portland, Oregon, EE. UU.

Departamento de Fisiología y Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Ciencias y Salud de Oregón, Portland, Oregón, EE. UU.

División de Hematología y Oncología Médica, Departamento de Medicina, Universidad de Salud y Ciencias de Oregón, Portland, Oregón, EE. UU.

Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University, Portland, Oregon, EE. UU.

División de Hematología y Oncología Médica, Departamento de Medicina, Universidad de Salud y Ciencias de Oregón, Portland, Oregón, EE. UU.

Departamento de Biología Celular, Desarrollo y Cáncer, Universidad de Ciencias y Salud de Oregón, Portland, Oregón, EE. UU.

Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University, Portland, Oregon, EE. UU.

División de Hematología y Oncología Médica, Departamento de Medicina, Universidad de Salud y Ciencias de Oregón, Portland, Oregón, EE. UU.

Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University, Portland, Oregon, EE. UU.

División de Bioinformática y Biología Computacional, Departamento de Informática Médica y Epidemiología Clínica, Universidad de Salud y Ciencias de Oregón, Portland, Oregón, EE. UU.

Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University, Portland, Oregon, EE. UU.

División de Hematología y Oncología Médica, Departamento de Medicina, Universidad de Salud y Ciencias de Oregón, Portland, Oregón, EE. UU.

Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University, Portland, Oregon, EE. UU.

División de Bioinformática y Biología Computacional, Departamento de Informática Médica y Epidemiología Clínica, Universidad de Salud y Ciencias de Oregón, Portland, Oregón, EE. UU.

Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University, Portland, Oregon, EE. UU.

División de Hematología y Oncología Médica, Departamento de Medicina, Universidad de Salud y Ciencias de Oregón, Portland, Oregón, EE. UU.

Departamento de Biología Celular, Desarrollo y Cáncer, Universidad de Ciencias y Salud de Oregón, Portland, Oregón, EE. UU.

Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University, Portland, Oregon, EE. UU.

División de Hematología y Oncología Médica, Departamento de Medicina, Universidad de Salud y Ciencias de Oregón, Portland, Oregón, EE. UU.

Departamento de Biología Celular, Desarrollo y Cáncer, Universidad de Salud y Ciencias de Oregón, Portland, Oregón, EE. UU.

Elie Traer, Universidad de Ciencias y Salud de Oregon, 3181 SW Sam Jackson Park Road, KR-HEM, Portland, OR 97239.

La leucemia mieloide aguda (LMA) es una enfermedad genéticamente heterogénea con aproximadamente 20 000 casos nuevos por año en los Estados Unidos. 1 Los pacientes con AML tienen una supervivencia a 5 años de & lt25%, y se están realizando intensos esfuerzos para desarrollar nuevos tratamientos para mejorar la supervivencia. 2 Mutaciones en la tirosina quinasa-3 similar a FMS (FLT3) se encuentran entre las aberraciones genómicas más comunes en la LMA. Duplicación interna en tándem (ITD) en el dominio de yuxtamembrana de FLT3 están presentes en aproximadamente el 20% de los pacientes con AML. Estas mutaciones provocan una actividad quinasa constitutiva y aumentan el riesgo de recaída y reducen la supervivencia. Otro conjunto de mutaciones en el dominio tirosina quinasa (TKD) de FLT3 ocurren en el 5-10% de los pacientes con AML y también dan lugar a la activación de FLT3. 3

Se han desarrollado múltiples inhibidores de la tirosina quinasa FLT3 y se pueden separar en dos clases. Los inhibidores de tipo I son competidores canónicos de ATP que se unen al sitio de unión de ATP de FLT3 en la conformación activa y son eficaces contra mutaciones de ITD y TKD. Por el contrario, los inhibidores de tipo II se unen a la región hidrófoba adyacente al dominio de unión de ATP en la conformación inactiva. Los inhibidores de tipo II son eficaces contra FLT3-ITD, pero no inhibir FLT3-Mutaciones de TKD. Quizartinib, un inhibidor de tipo II, tiene una potente actividad contra FLT3, KIT y RET. A pesar de las altas tasas de respuesta como monoterapia en pacientes con LMA en recaída / refractaria, la duración de la respuesta a quizartinib es de aproximadamente 4 meses y la resistencia a través de mutaciones de FLT3-TKD es común. 4, 5 Estas mutaciones ocurren con frecuencia en el residuo del bucle de activación D835 y con menos frecuencia en F691, que representa la posición de "guardián" en FLT3. 6

Gilteritinib es un inhibidor de segunda generación que se dirige a FLT3 y AXL. 7 Como inhibidor de tipo I, es activo contra mutaciones de TKD que imparten resistencia a quizartinib. Se aprobó como monoterapia en pacientes con LMA en recaída / refractarios con base en el estudio clínico aleatorizado de fase 3 (ADMIRAL) que comparó gilteritinib con quimioterapia. 8 A pesar del importante beneficio de supervivencia en el grupo de gilteritinib, la monoterapia está limitada por el desarrollo de resistencia, que generalmente ocurre después de 6 a 7 meses. La resistencia a gilteritinib ocurre más comúnmente a través de la adquisición / expansión de NRAS mutaciones, sin embargo, también se identificó una minoría de pacientes con mutaciones guardianas de F691L. 7 Para buscar mutaciones de resistencia adicionales a gilteritinib, Tarver et al. utilizó un ensayo de mutagénesis ENU bien establecido e identificó Y693C / N y G697S como mutaciones que confieren resistencia in vitro. 5 Estas mutaciones parecen funcionar de manera similar a la mutación gatekeeper al bloquear la unión de gilteritinib a FLT3, pero no se han informado en pacientes.

Para investigar más ampliamente los mecanismos de resistencia al gilteritinib, desarrollamos un modelo de resistencia de dos pasos que recapitula el papel del microambiente medular (Figura 1A). En la primera etapa de resistencia, o resistencia temprana, el FLT3Las líneas celulares de AML mutadas MOLM14 y MV411 se cultivan con ligandos exógenos, factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) y ligando FLT3 (FL), que normalmente son suministrados por las células del estroma de la médula. Estas condiciones de cultivo permiten que las células se vuelvan resistentes al gilteritinib sin necesidad de mutaciones de resistencia. 11 Cuando se eliminan los ligandos, las células recuperan la sensibilidad al gilteritinib, pero finalmente se vuelven resistentes, lo que denominamos resistencia tardía. En este punto, se identificaron mutaciones de resistencia intrínseca en todos los cultivos mediante la secuenciación del exoma completo. De manera similar a los datos clínicos, 8 encontramos que las mutaciones más comunes son mutaciones activadoras en NRAS. 12 Una cultura de resistencia tardía tuvo una FLT3 Mutación del portero F691L, y tres cultivos tuvieron una FLT3 Mutación N701K, que no se ha informado previamente (Figura 1B). Dada su proximidad a F691L (Figura 1C, D), planteamos la hipótesis de que esta mutación también podría interrumpir la unión de gilteritinib a FLT3.

Para determinar si el FLT3 La mutación N701K tiene capacidad oncogénica, evaluamos esta mutación en el ensayo de transformación Ba / F3. Las células Ba / F3 son normalmente dependientes de IL-3 pero la presencia de ciertos oncogenes las transforma para crecer indefinidamente en ausencia de IL-3. 13 El FLT3 Mutación N701K, similar a FLT3 ITD y FLT3 D835Y, es una mutación activadora y promovió el crecimiento de células Ba / F3 en ausencia de IL-3, mientras que el vector vacío parental, FLT3 tipo salvaje (FLT3 WT), o FLT3 F691L no confirió crecimiento independiente de IL-3 (Figura 1E).

En contraste con las células Ba / F3 que expresan FLT3 D835Y, celdas Ba / F3 con FLT3 N701K fueron mucho menos sensibles a gilteritinib con un aumento aproximado de 8.5 veces en la CI50 (Figura 1F). Para probar si FLT3 N701K también promovió la resistencia a gilteritinib en presencia de FLT3 Mutaciones ITD (Figura 1B), generamos FLT3 ITD + N701K y FLT3 ITD + F691L dobles mutantes y los expresó en células Ba / F3. Concordante con estudios previos, 6 el FLT3 El mutante ITD + F691L demostró un aumento aproximado de 11 veces en la CI50 a gilteritinib en comparación con FLT3-ITD solo. los FLT3 Las células ITD + N701K Ba / F3 eran casi idénticas a FLT3 Células ITD + F691L en su resistencia a gilteritinib (Figura 1G). Como control FLT3 Las células WT Ba / F3 cultivadas con IL-3 fueron insensibles a gilteritinib en dosis comparables.

A continuación, evaluamos el impacto de FLT3 Mutaciones de N701K en las vías de señalización de FLT3 aguas abajo. Las células Ba / F3 transformadas con FLT3 N701K, FLT3 ITD, FLT3 ITD + F691L y FLT3 ITD + N701K todos dieron como resultado la fosforilación de FLT3 (Y589 / 591) y STAT5 (Y694), AKT (S473) y ERK (T202 / Y204) (Figura S1A). Sin embargo, solo FLT3 ITD + N701K o FLT3 ITD + F691L mostró fosfo-FLT3 sostenido con concentraciones crecientes de gilteritinib (Figura 1H), lo que indica que ambas mutaciones previenen la inhibición de FLT3 por gilteritinib, particularmente a dosis más bajas. La actividad de la quinasa FLT3 reflejada por la fosforilación de FLT3 reflejó los ensayos de viabilidad en la Figura 1G.

Dado que se sabe que las mutaciones gatekeeper de F691L generan resistencia a múltiples inhibidores de FLT3, 6, 7, 14, 15 tratamos FLT3 ITD, FLT3 ITD + N701K y FLT3 Células ITD + F691L Ba / F3 con midostaurina, crenolanib y quizartinib. A pesar de que FLT3 ITD + F691L y FLT3 ITD + N701K fueron en gran parte insensibles a los inhibidores de tipo I midostaurina y crenolanib, células con FLT3 ITD + N701K fueron notablemente más sensibles al inhibidor de tipo II quizartinib (Figura S2), lo que sugiere que N701K bloquea la unión de gilteritinib a los inhibidores de tipo I de manera más eficaz que el tipo II. Esto fue más evidente a partir de nuestro modelo de la FLT3 Mutación N701K. Mientras que la FLT3 La mutación N701K puede interferir estéricamente con la unión de gilteritinib, la unión de quizartinib no parece verse afectada (Figura S3).

A través de nuestros estudios, identificamos la novela FLT3 Mutación N701K además de la FLT3 Mutación del portero F691L. Usamos el sistema Ba / F3 para demostrar que N701K bloquea la unión de gilteritinib a FLT3, similar al guardián F691L, y promueve la resistencia a gilteritinib. Nuestros datos encajan perfectamente con los datos recientes de una pantalla de mutagénesis de células Ba / F3 con FLT3-ITD que identificó a F691L además de D698N, G697S e Y693C / N como mutaciones que impulsan la resistencia a gilteritinib. 5 El modelado de estas mutaciones indica que provocan la pérdida del enlace de hidrógeno que acomoda la cadena lateral FLT3, lo que lleva a un choque estérico entre el anillo de tetrahidropirano de gilteritinib y FLT3. 5 Dada la proximidad de N701K a estas mutaciones, especulamos que el mecanismo de resistencia a gilteritinib impartido por esta mutación es similar (Figura S3). Es importante destacar que estos métodos complementarios identifican un punto de acceso común para las mutaciones de resistencia a gilteritinib (Figura S4). Dado el uso cada vez mayor de gilteritinib en la clínica, anticipamos que probablemente se identificarán mutaciones de resistencia adicionales en los pacientes. Es de destacar que la mutación N701K parece ser más resistente a los inhibidores de tipo I pero conserva la sensibilidad a los inhibidores de tipo II como quizartinib (Figura S2), lo que implica que el cambio de clase de TKI podría servir como una vía prometedora para mitigar el desarrollo de resistencia a gilteritinib. El uso de inhibidores de FLT3 de tipo I después de la adquisición de resistencia a los inhibidores de tipo II es un enfoque bien establecido para superar la resistencia. Sin embargo, lo que hace interesante el caso de la mutación N701K es la sensibilidad adquirida a un inhibidor de tipo II después del desarrollo de resistencia a un inhibidor de tipo I, que es un concepto en gran parte subestimado. Este conocimiento se puede utilizar para ayudar a secuenciar racionalmente los inhibidores de FLT3 tras el desarrollo de resistencia.


Materiales y métodos

Síntesis de ARN y preparación de muestras.

Se prepararon trifosfatos de nucleótidos marcados con 15 N, como se describió anteriormente (16, 17), a partir de Escherichia coli cultivado en medio mínimo M9 provisto de NH 15 N 4 C1 como única fuente de nitrógeno. 15 moléculas de ARN marcadas con N (hpGA, 5SDE y 5SE, ver Fig.1) fueron preparadas por in vitro transcripción con T7 ARN polimerasa (18, 19) a partir de plantillas de ADN sintético (MWG Biotech) de doble hebra (hpGA) o ADN plasmídico linealizado (5SDE, 5SE) que contienen las secuencias apropiadas. Estas moléculas se purificaron en una columna DEAE Sepharose FF (Amersham Pharmacia Biotech) desarrollada con un gradiente escalonado de acetato de sodio y posteriormente mediante HPLC en una columna preparativa C18 (Vydac 218TP510), equilibrada con 50 mM de KH 2 correos 4 / K 2 HPO 4 e hidrogenosulfato de tetrabutilamonio 2 mM a pH 5,9 en agua empleando un gradiente de acetonitrilo. En el caso de hpGA y 5SDE, una pequeña cantidad de producto N + 1 no se separó del producto principal. La plantilla 5SE se fusionó con una secuencia de ribozimas de cabeza de martillo. La transcripción resultante experimentó una autoescisión en el extremo 3 'de 5SE (20) y no se observaron productos adicionales (N + 1, N-1) en este caso. Los productos liofilizados se desalaron con una columna de filtración en gel NAP-25 (Amersham Pharmacia Biotech) y se precipitaron dos veces con 5 vol de perclorato de litio al 2% (p / v) en acetona. hpGA se desnaturalizó a 95 ° C a una concentración de 0,03 mM en tampón de RMN diluido 10 veces (NaCl 100 mM, NaH 10 mM 2 correos 4 /N / A 2 HPO 4 , EDTA 2,5 mM, pH 6,9) y se enfrió lentamente a temperatura ambiente durante un período de 3 h. 5SDE y 5SE se plegaron en forma de horquilla monomérica desnaturalizando a 95 ° C a una concentración de 0,25 mM y posterior dilución de 5 veces en agua helada y finalmente intercambiados en tampón de RMN (5 mM KH 2 correos 4 / K 2 HPO 4 , KCl 60 mM y CaCl 8 mM 2 , pH 5,75 para 5SDE o NaH 20 mM 2 correos 4 /N / A 2 HPO 4 , KCl 0,1 M, MgCl 4 mM 2 , NaN 3 mM 3 , pH 7,2 para el complejo 5SE-L25) utilizando microconcentradores Centricon-3 (Amicon, Inc.). Se preparó la proteína ribosómica L25 y se formó el complejo 5SE-L25 mediante titulación como se describió anteriormente (20). Las concentraciones finales de la muestra fueron ~ 1,7 mM para 5SDE y ~ 0,8 mM para hpGA y el complejo 5SE-L25.

Espectroscopia de RMN

Los experimentos de RMN se realizaron en un Varian UNITY INOVA 600 MHz, una UNIDAD de Varian INOVA 750 MHz o un espectrómetro Broker DMX 600 MHz. Todos los espectros se procesaron y analizaron utilizando Vnmr, Xeasy (21) y NMRpipe (22). Los espectros de RMN se registraron en 95% de H 2 O / 5% D 2 O a una temperatura de 10 ° C (hpGA) o 25 ° C (complejo 5SDE y 5SE-L25) utilizando el esquema de supresión de agua WATERGATE (23) que incluye pulsos de retroceso de agua (24).

Se registró un espectro 1 H-1 H-NOESY a 750 MHz para hpGA con una matriz de datos que consta de 400 (t 1 × 960 (t 2 ) puntos de datos complejos. Se utilizaron anchos de barrido de 9000 y 16 000 Hz en F1 y F2, respectivamente, y un tiempo de mezcla NOE de 150 ms. Un total de 128 exploraciones por complejo t 1 se recogieron incrementos. El portador de 1 H se colocó a 6,8 p.p.m. Durante t 1 y en la H 2 O resonancia durante t 2 y el portador de 15 N a 195 p.p.m. Se empleó desacoplamiento de 15 N durante la adquisición de datos. Los datos se rellenaron con ceros hasta puntos de datos complejos de 4K × 4K y se apodizaron utilizando funciones de coseno al cuadrado en ambas dimensiones antes de la transformación de Fourier.

Secuencias y estructuras secundarias de las moléculas de ARN utilizadas en este estudio. Los pares de bases que no son de Watson-Crick con enlaces de hidrógeno NH ⋯ N están sombreados. hpGA, estructura secundaria de hpGA. La región encuadrada indica la secuencia estudiada por Wu et al. (4). El (pseudo) eje de simetría doble de la molécula está indicado por un óvalo negro. El esquema de numeración es según (4). 5SDE, estructura secundaria de 5SDE, que contiene nucleótidos 70–106 de E. coli ARN ribosómico 5S. 5SE, estructura secundaria de 5SE, que contiene los nucleótidos 70-82 y 94-106 de E. coli ARN ribosómico 5S. La región de protuberancia interna conocida como E-loop está indicada para 5SDE y 5SE.

Secuencias y estructuras secundarias de las moléculas de ARN utilizadas en este estudio. Los pares de bases que no son de Watson-Crick con enlaces de hidrógeno NH ⋯ N están sombreados. hpGA, estructura secundaria de hpGA. La región encuadrada indica la secuencia estudiada por Wu et al. (4). El (pseudo) eje de simetría doble de la molécula está indicado por un óvalo negro. El esquema de numeración es según (4). 5SDE, estructura secundaria de 5SDE, que contiene nucleótidos 70–106 de E. coli ARN ribosómico 5S. 5SE, estructura secundaria de 5SE, que contiene los nucleótidos 70-82 y 94-106 de E. coli ARN ribosómico 5S. La región de protuberancia interna conocida como E-loop está indicada para 5SDE y 5SE.

Se registraron espectros 3D 1 H- 1 H- 15 N-NOESY-HSQC a 750 MHz para 5SDE y el complejo 5SE-L25 con 192 (t 1 × 44 (t 2 ) × 512 (t 3 ) puntos de datos complejos, ocho exploraciones por incremento, anchos espectrales de 11 300 Hz, 2190 Hz y 16 000 Hz en F1, F2 y F3, respectivamente, y un tiempo de mezcla NOE de 80 ms. El portador de 1 H se colocó a 6,8 p.p.m. Durante t 1 y en la H 2 O resonancia durante la adquisición. El portador de 15 N se colocó a 120 p.p.m. y se utilizó un desacoplamiento de 15 N durante la adquisición. Los datos se rellenaron con ceros hasta 1K × 128 × 1K puntos de datos complejos en F1, F2 y F3, respectivamente, y se apodizaron usando funciones coseno en todas las dimensiones antes de la transformación de Fourier.

El 2 J HN - Se registraron experimentos de 1 H-15 N-HSQC a 600 MHz como un WATERGATE convencional (23) con retroceso de agua (24) 1 H-15 N-HSQC (hpGA) o de acuerdo con Sklenar et al. (25) (5SDE, complejo 5SE-L25) con los retardos de transferencia INEPT establecidos en 10 ms. Las matrices de datos consistieron en 256 (t 1 ) × 800 (t 2 ) puntos de datos complejos. Un total de 64 exploraciones por t 1 se recogieron incrementos. Los anchos espectrales fueron 7000 Hz en la dimensión de 15 N y 12000 Hz en la dimensión de 1 H. Los experimentos se realizaron con el portador de 1 H colocado en el H 2 O resonancia y el portador de 15 N a 195 p.p.m. Los datos se rellenaron con ceros hasta 2K × 2K puntos de datos complejos y se apodizaron usando funciones coseno en ambas dimensiones antes de la transformación de Fourier. El cuantitativo J NN Los experimentos de HNN-COSY se realizaron como se describió previamente (1). Las matrices de datos consistieron en 128 (t 1 ) × 800 (t 2 ) (Complejo 5SE-L25) o 350 (t 1 × 800 (t 2 puntos de datos complejos (5SDE y hpGA). Un total de 64 (5SDE, hpGA) o 256 (5SE-L25) escaneos por t 1 se recogieron incrementos. Los anchos espectrales fueron 7000 Hz en la dimensión de 15 N y 12000 Hz en la dimensión de 1 H. Los experimentos se realizaron con el portador de 1 H colocado en el H 2 O resonancia y el portador de 15 N a 153 p.p.m. para el 1 H-15 N-INEPT y a 194 p.p.m. durante el paso NN-COSY. Se utilizó un tiempo de mezcla de 30 ms para la transferencia NN-COSY. Los datos se rellenaron con ceros hasta 512 x 2K puntos de datos complejos y se apodizaron usando funciones coseno en ambas dimensiones antes de la transformación de Fourier. La cuantificación de las 2h J NN -Las constantes de acoplamiento se llevaron a cabo como se describió anteriormente sin corregir una subestimación del 10-20% debido al ancho de banda de excitación finito de los pulsos de radiofrecuencia de 15 N (1).

Asignación de un 2h J NN acoplamiento en hpGA a un par de bases GA con un enlace de hidrógeno G N1H1-A N1. ( A ) Geometría de un par de bases GA unidas por imino-hidrógeno (izquierda) en comparación con un par de bases Watson-Crick GC (derecha). ( B ) Sección transversal unidimensional de un espectro 2D 1 H-1 H-NOESY tomado en el desplazamiento químico del hidrógeno G5 / G5 ′ H1 que muestra el pico cruzado NOE fuerte al hidrógeno A4 / A4 ′ H2. ( C ) Espectro HNN-COSY de hpGA que muestra correlaciones cruzadas entre los hidrógenos G H1 y los nitrógenos G N1 y C N3 (líneas negras discontinuas) típicas de los pares de bases de Watson-Crick GC y entre el hidrógeno G5 / G5 ′ H1 y el G5 / G5 ′ N1 y nitrógenos A4 / A4 ′ N1 (línea roja). ( D ) 2 J HN - Espectro 1 H-15 N-HSQC de hpGA que muestra la correlación del hidrógeno A4 / A4 ′ H2 con los nitrógenos A4 / A4 ′ N1 y N3 (línea azul). Los rangos de desplazamiento químico típicos de los átomos de nitrógeno relevantes se indican en el lado derecho del espectro.

Asignación de un 2h J NN acoplamiento en hpGA a un par de bases GA con un enlace de hidrógeno G N1H1-A N1. ( A ) Geometría de un par de bases GA unidas por imino-hidrógeno (izquierda) en comparación con un par de bases Watson-Crick GC (derecha). ( B ) Sección transversal unidimensional de un espectro 2D 1 H-1 H-NOESY tomado en el desplazamiento químico del hidrógeno G5 / G5 ′ H1 que muestra el pico cruzado NOE fuerte al hidrógeno A4 / A4 ′ H2. ( C ) Espectro HNN-COSY de hpGA que muestra correlaciones cruzadas entre los hidrógenos G H1 y los nitrógenos G N1 y C N3 (líneas negras discontinuas) típicas de los pares de bases de Watson-Crick GC y entre el hidrógeno G5 / G5 ′ H1 y el G5 / G5 ′ N1 y nitrógenos A4 / A4 ′ N1 (línea roja). ( D ) 2 J HN - Espectro 1 H-15 N-HSQC de hpGA que muestra la correlación del hidrógeno A4 / A4 ′ H2 con los nitrógenos A4 / A4 ′ N1 y N3 (línea azul). Los rangos de desplazamiento químico típicos de los átomos de nitrógeno relevantes se indican en el lado derecho del espectro.


Interruptores moleculares en GPCR

Los GPCR son actores clave en la comunicación célula-célula y transmiten la señal a través de la acción coordinada de interruptores.

Hay dos tipos de interruptores: interruptores de palanca y cerraduras.

La acción de los interruptores puede ser permanente o temporal.

La activación de los receptores está asociada con la ruptura de las barreras hidrófobas y la entrada de moléculas de agua.

Los interruptores moleculares en los GPCR permiten pasar la señal desde el sitio de unión del agonista, generalmente ubicado cerca de la superficie extracelular, a la parte intracelular del receptor. Los interruptores generalmente se asocian con motivos estructurales conservados en hélices transmembrana (TM), y están acompañados de residuos adyacentes que proporcionan la señal al residuo central en el interruptor de palanca. En caso de que los bloqueos sean los interruptores moleculares, se rompen (permanente o temporalmente) al unirse al agonista. La acción en cascada de los interruptores se correlaciona con la entrada de moléculas de agua para formar una vía que une ambos lados del receptor. Los interruptores eliminan las barreras hidrófobas y facilitan el movimiento del agua, mientras que las moléculas de agua ayudan a reorganizar la red de enlaces de hidrógeno dentro del receptor.


2 ESTRUCTURA GENÓMICA Y CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS DEL SARS-COV-2

Los coronavirus pertenecen al orden Nidovirales de la familia Coronaviridae. Coronavirinae y Torovirinae las subfamilias están separadas de la familia. La subfamilia Coronavirinae se divide además en cuatro géneros: Alfa-, Beta-, Gama- y Deltacoronavirus. 15 El análisis filogenético reveló que el SARS-CoV-2 está estrechamente relacionado con los beta-coronavirus. De manera similar a otros coronavirus, el genoma del SARS-CoV-2 es ARN monocatenario de sentido positivo [(+) ssRNA] con una cola 5'-cap, 3'-UTR poli (A). La longitud del genoma del SARS-CoV-2 es inferior a 30 kb, en el que hay 14 marcos de lectura abiertos (ORF), que codifican proteínas no estructurales (NSP) para los procesos de replicación y ensamblaje del virus, proteínas estructurales que incluyen spike (S) , envoltura (E), membrana / matriz (M) y nucleocápside (N), y proteínas accesorias. 16, 17 El primer ORF contiene aproximadamente el 65% del genoma viral y se traduce en poliproteína pp1a (nsp1-11) o pp1ab (nsp1-16). Entre ellos, seis nsps (NSP3, NSP9, NSP10, NSP12, NSP15 y NSP16) juegan papeles críticos en la replicación viral. Otros ORF codifican proteínas estructurales y accesorias. 18, 19 La proteína S es una proteína transmembrana que facilita la unión de la envoltura viral a los receptores de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) expresados ​​en la superficie de la célula huésped. Funcionalmente, la proteína de pico está compuesta por subunidades de unión al receptor (S1) y de fusión de la membrana celular (S2). 20 La proteína N se adhiere al genoma viral y participa en la replicación del ARN, la formación de viriones y la evasión inmune. La proteína de la nucleocápside también interactúa con las proteínas nsp3 y M. 21 La proteína M es una de las proteínas más abundantes y mejor conservadas en la estructura del virión. Esta proteína promueve el ensamblaje y la gemación de partículas virales a través de la interacción con N y proteínas accesorias 3a y 7a. 22, 23 La proteína E es el componente más pequeño de la estructura del SARS-CoV-2 que facilita la producción, maduración y liberación de viriones. 18

El componente más complejo del genoma de los coronavirus es el dominio de unión al receptor (RBD) en la proteína de pico. 24, 25 Se necesitan seis aminoácidos RBD para unirse al receptor ACE2 y albergar coronavirus similares al SARS-CoV. Según la alineación de secuencias múltiples, son Y442, L472, N479, D480, T487 e Y4911 en SARS-CoV, y L455, F486, Q493, S494, N501 e Y505 en SARS-CoV-2. 26 Por lo tanto, el SARS-CoV-2 y el SARS-CoV varían con respecto a cinco de estos seis residuos. Las secuencias del genoma de la cepa del SARS-CoV derivadas de seres humanos eran muy parecidas a las de los murciélagos. Aun así, se han identificado varias diferencias entre las secuencias génicas del gen S y las secuencias génicas ORF3 y ORF8 que codifican las proteínas de unión y fusión y las proteínas de replicación, respectivamente. Se demostró que 27 cepas específicas de MERS-CoV derivadas de camellos eran idénticas a las extraídas de humanos, con la excepción de las diferencias entre las regiones genómicas S, ORF4b y ORF3. 28 Además, los experimentos basados ​​en la secuenciación del genoma han demostrado que las cepas humanas de MERS-CoV están ligadas filogenéticamente a las de los murciélagos. Sin embargo, para las proteínas S, las especies tienen un genoma y estructuras proteicas similares. 29 Sobre la base de los estudios de recombinación de genes que codifican orf1ab y S, el MERS-CoV se derivó del intercambio de elementos genéticos entre coronavirus en camellos y murciélagos. En comparación, con una identificación general del 96%, la proteasa primaria está fuertemente protegida entre el SARS-CoV-2 y el SARS-CoV. 29-31

La proteína ACE2 se encuentra en muchos tejidos corporales de mamíferos, principalmente en los pulmones, riñones, tracto gastrointestinal, corazón, hígado y vasos sanguíneos. 32 Los receptores ACE2 son elementos vitales en la regulación de la vía del sistema renina-angiotensina-aldosterona. Basado en experimentos estructurales y estudios bioquímicos, el SARS-CoV-2 parece tener un RBD que se une fuertemente a los receptores ACE2 de humanos, gatos, hurones y otros organismos con receptores homólogos. 33

Se demostró que la secuenciación del genoma del SARS-CoV-2 en enero de 2020 era 96% idéntica al genoma RaTG13 del coronavirus de murciélago (BatCoV) y 80% idéntica al genoma del SARS-CoV. 34 Sin embargo, existen diferencias significativas. Por ejemplo, la secuencia de la proteína 8a en el genoma del SARS-CoV está ausente en el 2019-nCoV, y la secuencia de la proteína 8b del SARS-CoV-2 es 37 aminoácidos más larga que la del SARS-CoV. 35

El análisis de la secuencia de alineación del genoma de CoV indica que las proteínas estructurales y no estructurales son idénticas en un 60% y un 45%, respectivamente, entre varios tipos de CoV. 36 Estos datos muestran que las nsps son más conservadoras que las proteínas estructurales. Los virus de ARN tienen una carga mutacional más alta como resultado de tiempos de replicación más cortos (Figura 1). 36 Según estudios genómicos comparativos entre el SARS-CoV-2 y los coronavirus similares al SARS, hay 380 sustituciones de aminoácidos en los genes nsps y 27 mutaciones en los genes que codifican la proteína de pico S del SARS-CoV-2. Estas variaciones podrían explicar los diferentes patrones de comportamiento del SARS-CoV-2 en comparación con los SARS-CoV. 8 Por ejemplo, la mutación primaria N501 T en la proteína Spike del SARS-CoV-2 podría haber aumentado significativamente su afinidad de unión a ACE2. 37

2.1 Patogenia del SARS-CoV-2

La entrada del SARS-CoV-2 en las células huésped y la liberación de sus genomas en las células diana depende de una secuencia de pasos. El virus usa el pico de proteína, que es importante para evaluar el tropismo y la transmisibilidad del virus. Además, el SARS-CoV-2 incluso se dirige a las células epiteliales respiratorias humanas con receptores ACE2, lo que indica una estructura de RBD similar al SARS-CoV. 38 Después de la unión del S1-RBD al receptor ACE2, las proteasas de la superficie de la célula huésped como TMPRSS2 (serina proteasa 2 transmembrana) actúan en un sitio crítico de escisión en S2. 38 Esto da como resultado la fusión de la membrana y la infección viral.Después de la entrada del virus, el ARN genómico no recubierto se traduce en poliproteínas (pp1a y pp1ab) y luego se ensambla en complejos de replicación / transcripción con vesículas de doble membrana inducidas por virus (DMV). Posteriormente, este complejo replica y sintetiza un conjunto anidado de ARN subgenómico mediante la transcripción del genoma, que codifica proteínas estructurales y algunas proteínas accesorias. Las partículas de virus recién formadas se ensamblan mediando el retículo endoplásmico y el complejo de Golgi. Por último, las partículas de virus brotan y se liberan en el compartimento del medio extracelular. Por lo tanto, comienzan tanto el ciclo de replicación viral como la progresión. 10

Dentro de las células del huésped, la supervivencia de los CoV del SARS se mantiene mediante múltiples estrategias para evadir el mecanismo inmune del huésped, que también puede generalizarse al SARS-CoV-2. 39, 40 Como resultado de la falta de patrones moleculares asociados a patógenos en los DMV que se originan en el primer paso de la infección por SARS-CoV, no son reconocidos por los receptores de reconocimiento de patrones del sistema inmunológico del huésped. 25 Nsp1 puede impedir las respuestas del interferón (IFN) -I a través de varios mecanismos, como el silenciamiento del sistema de traducción del huésped, la inducción de la degradación del ARNm del huésped y la represión de la fosforilación del transductor de señal del factor de transcripción y del activador de la transcripción (STAT) 1. Nsp3 antagoniza la producción de interferón y citocinas al bloquear la fosforilación del factor de regulación del interferón 3 (IRF3) e interrumpir la vía de señalización del factor nuclear kappa B (NF-ΚB). Los NSP 14 y 16 cooperan para formar un casquete 5 'viral similar al del hospedador. Por tanto, las células del sistema inmunitario no reconocen el genoma del ARN viral. 41 Las proteínas accesorias ORF3b y ORF6 pueden interrumpir la vía de señalización de IFN inhibiendo la expresión de IFNβ dependiente de IRF3 y NF-KB y bloqueando la vía de señalización de JAK-STAT, respectivamente. Además, la señalización de IFN se aplana por las proteínas estructurales M y N, que dan como resultado una alteración en las señales de la quinasa 1 de unión a TANK (TBK1) / IKB quinasa ε y TRAF3 / 6-TBK1-IRF3 / NF-ΚB / AP1. 22, 39 Debido a que la mutación D614 G se encuentra en la proteína espiga externa del virus, esto atrae una gran cantidad de atención del sistema inmunológico humano y, por lo tanto, puede afectar la capacidad del SARS-CoV-2 para evitar la inmunidad inducida por la vacuna. D614 G no está en el RBD, aunque está involucrado en la interacción entre protómeros puntiagudos individuales que regulan su forma trimérica madura en la superficie del virión por enlaces de hidrógeno. 42 Korber et al. informó que la variante del SARS-CoV-2 en la proteína de pico D614 G se ha vuelto influyente en todo el mundo. Aunque clínico y in vitro La evidencia indica que D614 G altera el fenotipo del virus, el efecto de la mutación sobre la replicación, patogénesis, vacuna y desarrollo de la terapia es relativamente desconocido. 43 Desde in vitro y evidencia clínica, es evidente que D614 G tiene un fenotipo distinto, aunque no está claro si este es el resultado de una adaptación verificada a la ECA2 humana, así como si mejora la transmisibilidad o tendrá un impacto significativo. 43

2.2 Diagnóstico de COVID-19

El diagnóstico temprano y el aislamiento de los pacientes sospechosos juegan un papel vital en el control de este brote. 44 La especificidad y sensibilidad de las diferentes técnicas de diagnóstico difiere entre las poblaciones y los tipos de equipos empleados. 45 Se han recomendado varios procedimientos para el diagnóstico de COVID-19:

Los síntomas de COVID-19 se observan aproximadamente 5 días después de la incubación. 46 El tiempo medio de aparición de los síntomas a partir de la incubación de COVID-19 es de 5,1 días y los infectados presentan síntomas durante 11,5 días. 47 Se demostró que esta duración tiene un vínculo estrecho con el sistema inmunológico y la edad del paciente. Los síntomas gastrointestinales incluyen diarrea, vómitos y anorexia, registrados en casi el 40% de los pacientes. 48, 49 Hasta un 10% de los pacientes con síntomas gastrointestinales no presentan signos de fiebre o infecciones del tracto respiratorio. 50 COVID-19 también se ha relacionado con la enfermedad hipercoagulable, lo que aumenta el riesgo de trombosis venosa. 51 También hay registros de síntomas neurológicos (como fatiga, mareos y alteración de la conciencia), accidentes cerebrovasculares isquémicos y hemorrágicos y daño muscular. 52 Muchos síntomas extrapulmonares comprenden manifestaciones cutáneas y oculares. Los investigadores italianos han identificado manifestaciones cutáneas en el 20% de los pacientes. 53 El panorama clínico de los niños puede empeorar progresivamente como resultado de la insuficiencia respiratoria, que no pudo corregirse en 1 a 3 días con el oxígeno tradicional (es decir, un catéter nasal 54). En casos graves, las características distintivas son shock séptico, sepsis, hemorragia extrema y continua. como resultado de alteraciones de la coagulación y acidosis metabólica. 55

El shock séptico puede causar daños graves y dañar varios órganos, además de una infección pulmonar grave. Cuando se produce una disfunción del sistema extrapulmonar, incluidos los sistemas circulatorio y digestivo, es probable que se produzca un choque séptico y la tasa de mortalidad aumenta sustancialmente. 55 El parto prematuro y la hipoxia intrauterina ocurren cuando la prenata se ve privada de un ambiente adecuado de oxígeno. Los síntomas insidiosos requieren cuidados específicos en algunos recién nacidos y bebés prematuros. Los informes han indicado un buen pronóstico para los niños dentro de 1 o 2 semanas. 55 Los niños son propensos a una respuesta hiperinflamatoria al COVID-19 similar a la enfermedad de Kawasaki, que responde bien al tratamiento, para lo cual se está acuñando un nuevo término. 56

Los hallazgos de la mayoría de los análisis de sangre suelen ser inespecíficos, pero podrían ayudar a determinar las causas de la enfermedad. Un hemograma completo suele mostrar un recuento normal o bajo de glóbulos blancos y linfopenia. La proteína C reactiva (PCR) y la velocidad de sedimentación globular aumentaron en general, lo que de manera óptima se volvería a controlar los días 3, 5 y 7 después del ingreso. 1, 57, 58 Los niveles de creatina quinasa más mioglobina, aspartato aminotransferasa y alanina aminotransferasa, lactato deshidrogenasa, dímero D y creatina fosfoquinasa podrían aumentar en las formas graves de la enfermedad por COVID-19. Durante las coinfecciones víricas bacterianas, los niveles de procalcitonina pueden estar elevados. 59, 60 En una revisión sistemática y un estudio de metanálisis, Pormohammad et al. 61 investigaron los resultados de laboratorio accesibles obtenidos entre 2361 pacientes con SARS-CoV2, y los resultados demostraron 26% de leucopenia, 13,3% de leucocitosis y 62,5% de linfopenia. Además, entre 2200 pacientes, 91% y 81% revelaron plaquetas elevadas (trombocitosis) y PCR, respectivamente. 61 Además, una revisión de estudios de casos identificó el diagnóstico clínico y la modificación de los parámetros clínicos en un hombre de 47 años diagnosticado con la enfermedad en Wuweian. 62

Para investigar el efecto del coronavirus durante la fase aguda de la enfermedad, citocinas / quimiocinas plasmáticas factor de necrosis tumoral (TNF) -α e interleucina (IL) -1β, Se midieron IL1RA, IL2, IL4, IL5, IL-6, IL-10, IL13, IL15 e IL17A. 1, 63 Un estudio mostró que los macrófagos y las células dendríticas juegan un papel crucial en un sistema inmunológico adaptativo. Estas células contienen citocinas y quimiocinas inflamatorias, como IL-6, IL-8, IL-12, TNF-α, proteína quimioatrayente de monocitos 1, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos y factor estimulante de colonias de granulocitos. Estas reacciones inflamatorias pueden causar una inflamación sistémica. 64

El examen de rayos X de tórax puede mostrar diversas características o patrones de imágenes en pacientes con COVID-19 con una enfermedad de diferente gravedad y duración. Los resultados de las imágenes difieren según la edad del paciente, el estadio de la enfermedad durante el cribado, la competencia inmunitaria y los protocolos de tratamiento farmacológico. 66 Por otro lado, la imagenología computarizada (TC) es esencial para monitorear la progresión de la enfermedad y evaluar la efectividad terapéutica. Se puede volver a examinar 1 a 2 días después de la admisión, según el Reglamento de protocolos de diagnóstico y tratamiento (DTPR). 67

El sello distintivo de COVID-19 fueron las opacidades en vidrio esmerilado múltiples, bilaterales, posteriores y periféricas con o sin consolidación pulmonar y, en casos graves, sombras infiltrantes. 68 El análisis de la autopsia de un paciente con COVID-19 mostró acumulación de líquido y formación de membrana hialina en las paredes alveolares, que puede ser el principal impulsor patológico de la opacidad en vidrio esmerilado. 69

Sin embargo, estudios posteriores indicaron que en los pacientes con COVID-19 generalmente se observan pequeñas sombras irregulares, cambios pleurales, una línea curvilínea subpleural y signos de halo invertidos. 70, 71 Las líneas intralobulillares y los tabiques interlobulillares engrosados ​​se mostraban en un patrón de pavimento loco sobre el fondo de opacidad de vidrio deslustrado. 67 Además, se pueden encontrar varias lesiones lobares en el sistema respiratorio en niños con una infección grave. La evidencia mostró que las manifestaciones de la TC de tórax (edema pulmonar) informadas para COVID-19 son generalmente cercanas al SARS y al MERS. 69

El diagnóstico clínico de COVID-19 se centra principalmente en los datos epidemiológicos, los síntomas clínicos y algunas tecnologías adyuvantes, como la detección de ácidos nucleicos y los ensayos inmunológicos. Además, el aislamiento del SARS-CoV-2 requiere equipo de alto rendimiento (nivel de bioseguridad 3) para garantizar la seguridad del personal. Además, las pruebas serológicas aún no han sido validadas. En el campo del diagnóstico molecular, existen tres cuestiones principales: (i) disminuir el número de falsos negativos mediante la detección de cantidades mínimas de ARN viral (ii) evitar el número de falsos positivos mediante la correcta diferenciación de señales positivas entre diferentes patógenos y ( iii) una alta capacidad para realizar pruebas rápidas y precisas de un gran número de muestras en poco tiempo. 73

2.3 Detección de ácidos nucleicos

Dos tecnologías ampliamente utilizadas para la detección de ácidos nucleicos del SARS-CoV-2 son la RT-PCR en tiempo real (rRT-PCR) y la secuenciación de alto rendimiento. Sin embargo, como resultado de la dependencia del equipo y los altos costos, la secuenciación de alto rendimiento en el diagnóstico clínico está restringida. El acceso a toda la estructura del genoma del SARS-CoV-2 ha ayudado al diseño de cebadores específicos y ha introducido los mejores protocolos de diagnóstico. 47, 74 En los primeros informes publicados sobre la aplicación de la rRT-PCR en el diagnóstico de COVID-19, la selección de la región (S) del gen de la espiga del SARS-COV-2 ha mostrado una especificidad notable y una sensibilidad limitada. 68 Más tarde, la sensibilidad de esta técnica mejoró enormemente mediante el uso de sondas específicas para los otros genes específicos del virus, incluida la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) en la región ORF1ab, Nucleocapsid (norte) y envolver (mi). Para evitar la reacción cruzada con otros coronavirus humanos y prevenir la posible deriva genética del SARS-CoV-2, se deben involucrar dos objetivos moleculares en este ensayo: un objetivo no específico para detectar otros CoV y un objetivo específico para el SRAS-CoV-2 . La comparación de los resultados obtenidos de la selección de todos los genes estudiados mostró que la RdRp El gen es el objetivo más apropiado con la mayor sensibilidad. Los ensayos de RdRp se validaron en aproximadamente 30 laboratorios europeos utilizando tecnología de ácido nucleico sintético. 73 Actualmente, Chan et al. 75 han propuesto un nuevo ensayo de RT-PCR dirigido a una secuencia de RdRp / Hel que podría detectar una carga baja de SARS-CoV-2 en el tracto respiratorio superior, muestras de plasma y saliva sin ninguna reactividad cruzada con otros virus respiratorios comunes. Aunque los ensayos recomendados por los CDC en los EE. UU. Se basan en dos proteínas de la nucleocápside N1 y N2, la OMS recomienda el ensayo del gen E como prueba de detección de primera línea, seguido del ensayo del gen RdRp como prueba de confirmación. Basado en la evidencia más reciente, el panel QIAstat-Dx SARS-CoV-2, un sistema multiplexado de RT-PCR en tiempo real dirigido a genes RdRp y MI, sigue siendo muy sensible a pesar de las variaciones de nucleótidos que afectan la hibridación del ensayo de PCR. 76

Generalmente, la RT-qPCR cuantitativa (RT-PCR) tiene una alta especificidad como ensayo estándar de oro para el diagnóstico final de COVID-19. Sin embargo, su sensibilidad podría variar según la carga viral, la técnica de extracción de ARN, la fuente de muestreo y el estadio de la enfermedad durante el tiempo de muestreo. De hecho, los resultados falsos positivos de RT-PCR están relacionados con la contaminación cruzada de muestras y errores de manipulación. Por el contrario, las inexactitudes durante cualquier etapa de la recolección, el almacenamiento y el procesamiento de las muestras pueden dar lugar a resultados falsos negativos. Algunos estudios han revelado que las muestras del tracto respiratorio superior (parte inferior de las fosas nasales y la orofaringe) son más deseables para el ensayo de RT-PCR como resultado de muchas copias virales. 77 Además, otras deficiencias de los ensayos de RT-qPCR incluyen los peligros de seguridad biológica que surgen del mantenimiento y el trabajo en muestras de pacientes, así como un proceso de detección de ácido nucleico engorroso y que requiere mucho tiempo. 66, 68

Para mejorar las técnicas de diagnóstico molecular para COVID-19, actualmente se están desarrollando métodos basados ​​en amplificación isotérmica. La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) utiliza la ADN polimerasa y de 4 a 6 cebadores diferentes que se unen a las distintas secuencias del genoma diana. 78 En las reacciones LAMP, el ADN amplificado está indicado por la turbidez que surge de un subproducto de la reacción, un color detectable generado por un tinte sensible al pH o la fluorescencia producida por un tinte fluorescente. 79 La aproximación ocurre a una sola temperatura, en menos de 1 hora y con señales de fondo mínimas. La prueba de diagnóstico LAMP para COVID-19 es más específica y sensible en comparación con los ensayos convencionales de RT-PCR y no depende de equipos de laboratorio especializados, como un termociclador. Sin embargo, como resultado de la multiplicidad de cebadores utilizados en este método, optimizar las condiciones de reacción presenta un desafío importante. 80, 81

2.4 Técnica basada en microarrays

Las técnicas inmunológicas y de detección de antígenos pueden utilizarse para un diagnóstico rápido y rentable al mismo tiempo que proporcionan una alternativa a los métodos moleculares. Las técnicas inmunológicas que incluyen el ensayo de inmunofluorescencia, la prueba de anticuerpos de fluorescencia directa, el ensayo de detección de proteína de la nucleocápside, el chip de proteína, los puntos cuánticos de semiconductores y el ensayo de microneutralización definen una unión entre un antígeno viral y un anticuerpo específico. 88-91 Estos métodos inmunológicos son simples de operar pero tienen baja especificidad / sensibilidad. En el caso de COVID-19, la morfología del virus se puede observar mediante microscopía electrónica de acuerdo con los postulados tradicionales de Koch. 92, 93 Las pruebas serológicas pueden mejorar la detección de coronavirus, de modo que los antígenos y anticuerpos monoclonales asociados pueden representar un nuevo enfoque de diagnóstico para el desarrollo futuro (Figura 2). 94, 95

Las pruebas serológicas pueden ser específicas para un tipo de inmunoglobulina, pueden medir simultáneamente anticuerpos IgM e IgG, o pueden ser exámenes de anticuerpos absolutos, que a menudo miden anticuerpos IgA. 96 Según el procedimiento y el dispositivo específicos, estos experimentos generalmente se llevarán a cabo dentro de 1 a 2 horas después de que una muestra llegue al laboratorio y se cargue en la plataforma adecuada. 97 Guo et al. 98 indicó que los anticuerpos IgA e IgM tienen tasas positivas de 93,0% y 85,5% después de 3-6 días, respectivamente. Además, el 78,0% de los anticuerpos IgG positivos se detectaron durante 10 a 18 días. La eficacia de detección mediante un ensayo inmunposorbente ligado a enzimas (ELISA) de IgM es mayor que la de qPCR después de 5,5 días de la aparición de los síntomas. Después de 5 días, la detección de ELISA de IgM es más eficaz que una qPCR.

Además, la combinación de PCR e IgM ELISA aumentó la tasa de detección en un 98,5%. 98 Xiang et al. 99 analizaron a 63 pacientes infectados de SARS-CoV-2 ingresados ​​en el Hospital Jinyintan en Wuhan, Hubei, China. Las muestras de suero de los pacientes se evaluaron mediante ELISA y captura indirecta de IgG por ELISA. Los resultados del estudio indican que la IgM fue positiva con una precisión del 64,3%, una sensibilidad del 44,4% y una especificidad del 100% en 28 de 63 muestras. La identificación de la muestra de 52 casos también mostró una prueba de IgG positiva con una sensibilidad del 82,54%, una especificidad del 100% y una precisión del 88,8%. Además, se logró una sensibilidad del 87,3% utilizando análisis de combinación de IgM e IgG. 99

2.5 Técnica CRISPR

La detección de ácidos nucleicos con CRISPR-Cas13a / C2c2 es una plataforma de detección molecular muy rápida, sensible y específica, que puede ayudar en la epidemiología, el diagnóstico y el control de la enfermedad. Además, Cas13a / C2c2 puede detectar la expresión de transcripciones en células vivas y diferentes enfermedades. 101, 102 Zhang y col. presentó un protocolo para la detección de COVID-19 utilizando la técnica SHERLOCK (Desbloqueo de reportero enzimático específico de alta sensibilidad) basada en el diagnóstico CRISPR. Los fragmentos de ARN del virus SARS-CoV-2 ayudan a detectar secuencias diana de aproximadamente 100 copias. El experimento se realiza mediante amplificación isotérmica del ácido nucleico extraído de muestras de pacientes y luego amplificación de la secuencia de ARN viral a través de Cas13 y finalmente se lee con una tira reactiva de papel en menos de 1 hora. 103, 104 Huang et al. 105 estableció un ensayo basado en CRISPR mediante un complejo CRISPR Cas12a / gRNA personalizado. Utilizaron una sonda fluorescente para identificar amplicones diana producidos por RT-PCR estándar o amplificación de polimerasa recombinasa isotérmica. Este método mostró una detección específica en lugares no equipados con los sistemas de PCR necesarios para las pruebas de diagnóstico de qPCR en tiempo real. El análisis permite la identificación de muestras positivas al SARS-CoV-2 con un tiempo de prueba a respuesta de aproximadamente 50 minutos y un límite de detección de dos copias de cada muestra a detectar. Los hallazgos de la prueba CRISPR en muestras nasales recolectadas de personas con COVID-19 fueron comparables con los datos coincidentes obtenidos de la prueba RT-qPCR aprobada por los CDC. 105

Provocada et al. 106 describió el desarrollo de una prueba de flujo lateral rápida (& lt 40 min), fácil de implementar y precisa basada en CRISPR-Cas12 para diagnosticar el SARS-CoV-2 a partir del extracto de ARN de un hisopo nasal. Mediante muestras de referencia artificiales y muestras clínicas de pacientes, que incluían pacientes diagnosticados con la enfermedad COVID-19 y 42 pacientes con otras enfermedades respiratorias, confirmaron su proceso. Este enfoque basado en CRISPR ha proporcionado una opción alternativa visual y más rápida al método de RT-PCR en tiempo real SARS-CoV-2 utilizado en los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de EE. UU., Con un acuerdo predictivo negativo de aproximadamente el 100% y un valor predictivo positivo del 95%. convenio. 106

2.6 Técnica basada en LAMP

La amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP) es un nuevo método de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos con gran eficacia. Esto se utiliza para amplificar ARN y ADN con alta especificidad y sensibilidad como resultado de su característica de amplificación exponencial y seis secuencias diana particulares diagnosticadas por cuatro cebadores separados. 107 El ensayo LAMP es rápido y no necesita reactivos o equipos de alto precio. Además, el método de electroforesis en gel se utiliza ampliamente para la investigación de los elementos amplificados para detectar puntos finales. Por lo tanto, la prueba LAMP ayudará a disminuir el costo de la detección de coronavirus. Aquí se definen varias estrategias para la detección de coronavirus basadas en LAMP, desarrolladas y realizadas en el diagnóstico clínico. 108

Poon et al. 109 han informado de una prueba LAMP simple en el estudio del SARS y han demostrado la viabilidad de este método para la detección del SARS-CoV.El sitio ORF1b del SARS-CoV se seleccionó para la detección del SARS y se amplificó en presencia de seis cebadores mediante la reacción LAMP, y luego se evaluaron los productos amplificados mediante electroforesis en gel. Los niveles de sensibilidad y detección en la prueba LAMP para el SARS están cerca de los de las técnicas tradicionales basadas en PCR. Pyrc et al. 110 aplicó con eficacia LAMP a la detección de HCoV-NL63 con una sensibilidad y especificidad deseables en cultivos de células móviles y muestras clínicas. En particular, se encontró que una réplica de la plantilla de ARN era responsable de la restricción de detección. La amplificación se observa como precipitación con colorante fluorescente o pirofosfato de magnesio. Estas técnicas se pueden lograr en tiempo real monitoreando la turbidez del pirofosfato o la fluorescencia, que superan correctamente la restricción de la detección del punto final. 110

Shirato et al. 111 desarrolló un ensayo RT-LAMP beneficioso para el diagnóstico y seguimiento epidemiológico del MERSCoV humano. Este método fue muy específico, sin ninguna reacción cruzada con otros virus respiratorios específicos, y detectó tan solo 3,4 copias de ARN. 111 Posteriormente, desarrollaron el ensayo RT-LAMP revelando un signo utilizando una sonda de extinción (QProbe), que tiene la misma eficacia que la prueba habitual de RT-PCR en tiempo real con respecto a la detección de MERSCoV. 112

Sobre la base de otra evidencia, se desarrolló un método de visualización de ácido nucleico que combina RT-LAMP y una tira de visualización de flujo vertical para la detección de MERS. 113

2.7 Tecnología Penn RAMP

Basado en la efectividad reportada por Zhang et al. 104 utilizando la LAMP comparativamente menos sensible, la sensibilidad mejorada de la técnica Penn-RAMP lograda por Huang et al. 114, que es atribuible a un protocolo LAMP actualizado de dos pasos, puede resultar sustancialmente eficaz como diagnóstico. Para amplificar dianas específicas mediante la amplificación de la polimerasa recombinasa, en la que todas las dianas se amplifican simultáneamente, Penn-RAMP requiere una reacción preliminar con cebadores LAMP externos. A continuación, se activa una siguiente reacción LAMP de alta precisión. Especialmente, la primera etapa usa cebadores LAMP externos F3 y B3, mientras que los otros cuatro cebadores RAMP se mezclan más en la etapa 2. En comparación con LAMP normal, este concepto 'anidado' mejoró considerablemente la sensibilidad de LAMP en aproximadamente 10-100 veces, especialmente cuando se trabaja con muestras destiladas y crudas. 115 Además, cuando se extendió a ensayos simulados, la metodología Penn-RAMP recibió una calificación de aprobación del 100% a 7-10 copias de ARN viral por reacción, en comparación con una calificación de aprobación del 100% a las 700 copias de ARN viral necesarias para el análisis de PCR. 114, 115

2.8 PCR digital de gotitas

Para la identificación y cuantificación directa de dianas de ADN y ARN, la PCR digital por gotitas (ddPCR) comprende una técnica extremadamente sensible. 116 Se ha utilizado ampliamente para enfermedades infecciosas, en particular debido a su capacidad para identificar algunas copias de genomas virales de forma precisa y eficaz. 117 Si la identificación de la existencia de virus de bajo nivel y / o residual es apropiada, los datos cuantitativos de ddPCR son mucho más reveladores que los proporcionados por las pruebas regulares de RT-PCR. En vista de la necesidad de restringir (en la medida de lo posible) los resultados falsos negativos en el diagnóstico de COVID-19, el uso del ddPCR puede proporcionar un apoyo vital. Aun así, el ensayo ddPCR todavía se estudia muy raramente en entornos clínicos y actualmente no hay evidencia disponible para casos europeos. 118

2.9 Técnica basada en secuenciación de próxima generación (NGS)

Los virus de ARN vienen en una gran variedad de variedades y son los especialistas etiológicos de numerosas enfermedades infecciosas humanas y animales importantes. 119

Los virus de ARN comprenden la variedad principal y son los agentes etiológicos de enfermedades muy infecciosas en humanos y animales tales como SARS, hepatitis, influenza e IB (bronquitis infecciosa aviar). La tecnología NGS de alto rendimiento tiene un papel vital en el diagnóstico primario y preciso. 120 Además, el método NGS puede detectar si varios tipos de virus comprenden un patógeno. La nueva y rápida técnica de virus mediante NGS, que incluye la secuenciación del ADN y la secuenciación del ARN, ha desarrollado la identificación de la diversidad viral. 121 La identificación de una amplia gama de patógenos utilizando tecnologías NGS también es importante para controlar la infección viral causada por un nuevo patógeno. 122 En los últimos años, el avance del método NGS a través de la secuenciación de ARN nos ha permitido hacer grandes avances en el reconocimiento rápido de nuevos virus de ARN. ARN-la secuenciación detecta millones de fragmentos de ADN transcritos de forma inversa a partir de muestras de ARN complejas al mismo tiempo utilizando cebadores aleatorios. 123 Chen et al. 122 informaron de un nuevo coronavirus de pato utilizando el método de secuenciación de ARN, que difería del del virus de la bronquitis infecciosa (IBV de pollo). 122 El nuevo CoV específico de pato era una posible nueva especie dentro del género Gamma-coronavirus, como lo muestran las secuencias del gen viral 1b de tres regiones.

En conclusión, el brote de un nuevo virus surgió a fines de diciembre de 2019. El COVID-19 se propagó de inmediato y desafió a la medicina, la economía y la salud pública en todo el mundo. Numerosas pruebas propusieron que los receptores ACE2 comprenden proteínas estructurales cruciales para la gemación y la entrada del virus en las células huésped. Se han reconocido tanto la transmisión de huéspedes intermediarios no identificados a especies cruzadas como la transmisión de humano a humano. Por tanto, la detección precoz y el aislamiento de los pacientes sospechosos pueden desempeñar un papel fundamental en el control de este brote. Actualmente, los métodos de diagnóstico para COVID-19 son numerosos, por lo que es imperativo elegir un protocolo de detección adecuado. Cada una de las técnicas descritas tiene sus ventajas y desventajas específicas. Para los pacientes con COVID-19 se recomiendan tanto las pruebas de imágenes por tomografía computarizada de tórax como las de RT-PCR. Sin embargo, el uso de PCR requiere varios equipos y un laboratorio bien establecido. LAMP se puede detectar con un número reducido de plantillas de ADN o ARN en 1 hora. El microarray es un método costoso para el diagnóstico de COVID-19, y otros métodos recientemente desarrollados también requieren investigación adicional para lograr un rápido desarrollo y detección en el futuro. Dado que el número de casos infectados está aumentando rápidamente, los estudios futuros deberían revelar los secretos de las vías moleculares del virus con respecto al desarrollo de vacunas dirigidas y tratamientos antivirales.


Abstracto

Los métodos funcionales de densidad se utilizan para examinar las geometrías y la energía de las moléculas que contienen un anillo de fenilo unido al SF bipiramidal trigonal.3 estructura. El anillo de fenilo tiene una fuerte preferencia por una posición ecuatorial. Esta preferencia permanece cuando uno o dos éter -CH2OCH3 se añaden grupos al anillo de fenilo, orto a SF3, donde una estructura apical tiene una energía casi 30 kcal / mol más alta. Ya sea ecuatorial o apical, la molécula se estabiliza mediante un enlace calcógeno S ··· O, a veces aumentado por enlaces CH ··· F o CH ··· O H-enlaces. Se estima que la fuerza del enlace S ··· O intramolecular se encuentra en el rango entre 3 y 6 kcal / mol. Un efecto secundario del enlace calcógeno S ··· O es el alargamiento de los enlaces S – F. La solvatación de la molécula refuerza la interacción S ··· O. La adición de sustituyentes al anillo de fenilo sólo tiene efectos modestos sobre la fuerza de unión S ··· O. Un fortalecimiento surge cuando se coloca un sustituyente que atrae electrones. orto al éter y meta a SF3, mientras que las especies liberadoras de electrones producen un efecto opuesto.


F3. Enlaces de hidrógeno

Linus Pauling sugirió por primera vez que los enlaces H (entre el agua y la proteína y dentro de la proteína misma) jugarían un papel dominante en el plegamiento y la estabilidad de las proteínas. Parecería tener sentido ya que los aminoácidos son dipolares y la estructura secundaria es común. Sin embargo, recuerde que los enlaces H se encontrarían no solo en el estado nativo sino también en el estado desnaturalizado. ¿Contribuyen de manera diferente a la estabilidad de los estados D vs N? Se han realizado muchos estudios experimentales y teóricos que investigan las transiciones de espirales helicoidales & lt === & gt (aleatorias) en péptidos pequeños. ¿Recuerda todos los enlaces H intracadena en la hélice? ¿Son colectivamente más estables que los enlaces H entre el agua y el péptido en una espiral (aleatoria)?

Al pensar en estudios conformacionales que involucran péptidos pequeños, es útil aplicar el principio de Le Chatelier al equilibrio a continuación:

Cualquier elemento perturbador (moléculas pequeñas, disolvente, etc.) que interactúe preferentemente con la forma helicoidal empujaría el equilibrio a la forma helicoidal.

Los primeros modelos asumieron que los enlaces H intracadena eran energéticamente (entalpicamente) más favorables que los enlaces H entre péptido y agua. Pero para formar un enlace de hidrógeno se requiere una recuperación de la entropía, ya que una hélice está mucho más ordenada (entropía más baja) que una bobina aleatoria (entropía más alta). A baja temperatura predomina la entalpía y se favorece la formación de hélice en solución. A alta temperatura, la hélice se desfavorece entrópicamente. Imagínese el aumento de los estados vibracionales y rotacionales permitidos a los átomos a temperaturas más altas. (Recuerde los cambios conformacionales de trans a gauche en las cadenas de acilo de anfífilos de doble cadena a medida que aumenta la temperatura, lo que lleva a una transición de una fase de gel a cristalina líquida en vesículas de dos capas). Los estudios teóricos sobre las transiciones de hélice-espiral predicen lo siguiente:

  • a medida que aumenta la longitud de la cadena, la hélice se vuelve más estable
  • aumentar la carga en la molécula desestabiliza la hélice, ya que la bobina, en comparación con la hélice más compacta, tiene una densidad de carga más baja
  • Los solventes que protonan el oxígeno del carbonilo (como el ácido fórmico) desestabilizan la hélice y
  • los disolventes que forman fuertes enlaces H compiten con el péptido y desestabilizan la hélice. Por el contrario, los disolventes como el CHCl3 y la dimetilformamida (un disolvente no protótico) estabilizan la hélice. Asimismo, el 2-cloroetanol y el trifluoroetanol, que no forman enlaces H al péptido o son más débiles que el agua, estabilizan la hélice. (En el caso del trifluoroetanol, las simulaciones de dinámica molecular han demostrado que el TFE interactúa preferentemente con (solvata) el péptido, que inhibe los enlaces H de la cadena principal del péptido al agua, estabilizando los enlaces H intrahelicales.

Estos estudios de hélice-espiral sugieren que los enlaces H son importantes para estabilizar una proteína.

¿Pero realmente lo hacen? ¿Por qué estos enlaces H deberían diferir de los del agua? Es difícil saber si lo son, ya que existen muchos enlaces H posibles (entre proteína y agua, agua y agua, y proteína y proteína), y su fuerza depende de su orientación y de la constante dieléctrica del medio en el que se encuentran. situado.

Si los enlaces H intracadena en una proteína no son muy diferentes en energía que los enlaces H intermoleculares entre la proteína y el agua, y dado que las proteínas son marginalmente estables a temperaturas fisiológicas, entonces el estado plegado debe contener aproximadamente la misma cantidad de enlaces de hidrógeno intramoleculares. dentro de la proteína como posibles enlaces H intermoleculares entre la proteína y el agua, de lo contrario la proteína se desplegaría.

Para resolver este problema y determinar la fuerza relativa de los enlaces H entre los diferentes donantes y aceptores posibles, se han realizado muchos estudios para comparar la energía de los enlaces H entre moléculas pequeñas en el agua con la energía de los enlaces H entre las mismas moléculas pequeñas pero en un disolvente apolar. El razonamiento es el siguiente. Si el interior de una proteína es más no polar que el agua (constante dieléctrica más baja que el agua), entonces los enlaces H entre cadenas en una proteína podrían modelarse observando los enlaces H entre moléculas pequeñas en disolventes no polares y haciendo la pregunta, ¿es la energía libre? cambiar para el siguiente proceso & lt 0:

donde D es un donante de enlace de hidrógeno (como NH) y A es un aceptor de enlace de hidrógeno, (como C = O), w es agua (es decir, el donante y el aceptor están en agua), yn es un disolvente no polar, y DG o y K son el cambio de energía libre estándar y la constante de equilibrio, respectivamente, para la formación de un enlace H en un disolvente no polar de un donante y un aceptor en agua. Esta reacción simula las contribuciones del enlace H al plegamiento de proteínas, donde un enlace H enterrado es imitado por un enlace H en un disolvente no polar. La reacción escrita anteriormente es realmente un experimento mental, ya que sería difícil establecer las condiciones necesarias para realizar la medición. Sin embargo, podemos calcular el D G o para esta reacción ya que es una función de estado y realmente no importa cómo se lleve a cabo este proceso.

Consideremos un ejemplo específico: la formación de enlaces H entre dos moléculas de N-metilacetamida (NMA) en agua y en un disolvente apolar. El esquema de reacción que se muestra a continuación describe un conjunto de reacciones (un ciclo termodinámico) que implican la formación de dímeros de NMA unidos a H. A y B son moléculas de NMA, ya sea en agua (w) o en un disolvente no polar (n).

La N-metilacetamida es un buen imitador de los donantes y aceptores del enlace H del enlace peptídico de una cadena polipeptídica.

En el esquema de reacción que se muestra arriba,

K 1 es la constante de equilibrio para la dimerización de NMA en un medio no polar. Esto se puede determinar fácilmente y es & gt1, lo que implica que D G o & lt 0. (Recuerde, D G o = -RTlnKeq) Para la dimerización de NMA en CCl4, D G o1 = -2,4 kcal / mol.

K 2 es la constante de equilibrio (piénselo como un coeficiente de partición) para la transferencia de dos moléculas de NMA del agua a un disolvente no polar (de nuevo, fácilmente medible). Para la transferencia de NMA del agua a CCl4, D G o2 = + 6,12 kcal / mol.

K 3 es la constante de equilibrio para la dimerización de NMA en agua. Esto se puede determinar fácilmente y es & lt1, lo que implica que D G o & gt 0. Para la dimerización de NMA en agua, D G o3 = +3,1 kcal / mol.

K 4 es la constante de equilibrio (considérelo como un coeficiente de partición) para la transferencia de un dímero de NMA unido a hidrógeno del agua a un disolvente apolar. ¡Intenta pensar en una forma de medir eso! No puedo. Aquí es donde los ciclos termodinámicos entran tan bien. No tienes que medirlo. ¡Puede calcularlo a partir de K1-3 ya que D G o es una función de estado!

D G o2 + D G o1 = D G o3 + D G o4 O -RTlnK2 + -RTlnK1 = -RTlnK3 + -RTlnK4

lnK2 + lnK1 = lnK3 + lnK4 = ln (K2K1) = ln (K3K4) o (K2K1) = (K3K4)

Para la transferencia de NMA del agua a CCl4, D G o4 = + 0,62 kcal / mol.

(Nota: a los bioquímicos les gusta hablar sobre ciclos termodinámicos que pueden parecer nuevos para usted. Sin embargo, lo crea o no, los ha visto antes, en Química general, ¡en la forma de la Ley de Hess!)

A partir de K1-4 y los valores correspondientes de D G o, ahora podemos calcular D G o5 para la formación de dímeros NMA unidos a H en un disolvente no polar a partir de dos moléculas de NMA (aq). Esta reacción, que esperamos simule la formación de enlaces H intracatenarios enterrados en proteínas en el plegamiento de proteínas, es :,
Dw + Aw & lt ======= & gt (DA) n, para el cual D G o5 = +3.72 (es decir, desfavorecido).

Si este modelo es un buen imitador para estudiar la formación de enlaces H en el plegamiento de proteínas, sugiere que la formación de enlaces H enterrados durante el plegamiento de proteínas no impulsa el plegamiento de proteínas.

Sin embargo, si la transferencia de D y A (de una proteína grande) del agua al medio no polar (modelado por K2) es impulsada por otras fuerzas (como el efecto hidrofóbico), el valor positivo de K1 favorecerá fuertemente el enlace H enterrado. formación. Entonces, si esto sucede en las proteínas, está claro por qué ocurren tantos enlaces H intracadena, ya que K1 es tan favorecido. Los enlaces H pueden no ayudar al colapso de una proteína, pero favorecerían la organización interna dentro de una proteína compacta. Es decir, los enlaces H no impulsan el plegamiento de proteínas per se, sino que se forman de modo que la proteína plegada no se desestabilice por demasiados enlaces H insatisfechos.

Existen problemas potenciales con este modelo simple. El interior de una proteína no es homogéneo (es decir, el dieléctrico eficaz dentro de la proteína variará). La fuerza de unión de H también es muy sensible a la geometría. Además, hay muchos enlaces H dentro de una proteína, por lo que pequeños errores en la estimación de la fuerza del enlace H conducirían a grandes errores en la determinación de la estabilidad de la proteína.

Otro argumento en contra de que los enlaces H sean el factor determinante en el plegamiento y la estabilidad de las proteínas proviene de estudios de desnaturalización con solventes. Si los enlaces de H intracatenarios son tan importantes, ¿no deberían los disolventes que pueden enlazar el H con la cadena principal desnaturalizar la proteína? ¿No debería el agua (55 M) actuar como desnaturalizante? Sin embargo, no es así. No se esperaría que el dioxano (anillo heterocíclico de 5 miembros con O) que solo tiene un aceptor de enlace H desnaturalice las proteínas, pero lo hace. Los enlaces H también aumentan en los disolventes no polares. Los péptidos que tienen estructuras aleatorias en el agua pueden inducirse a formar hélices cuando se colocan en soluciones alcohólicas (trifluoretanol, por ejemplo), que son más apolares que el agua, como se explicó anteriormente en los estudios de hélice-espiral. Si los enlaces H son el factor dominante en la estabilidad de las proteínas, los alcoholes estabilizarían las proteínas. A bajas concentraciones de alcohol, las proteínas se desestabilizan.

Por lo tanto, según los estudios de moléculas pequeñas y el estudio de proteínas en varios codisolventes, es poco probable que los enlaces H sean los grandes estabilizadores de la estructura de las proteínas. Solo el 11% de todos los C = O y el 12% de todos los NH en las proteínas no tienen enlaces H (determinado por análisis de estructuras cristalográficas de rayos X). De todos los enlaces de H a C = O, el 43% son al agua, el 11% a las cadenas laterales y el 46% a los NH de la cadena principal. De todos los enlaces de H a NH, el 21% son al agua, el 11% a las cadenas laterales y el 68% a la cadena principal C = O. Sin embargo, veremos más adelante que se llega a una conclusión opuesta a partir de estudios que utilizan mutagénesis de sitio específico.

/>
Biochemistry Online de Henry Jakubowski tiene una licencia internacional Creative Commons Reconocimiento-No comercial 4.0.


RESUMEN

El neuroblastoma es un tumor sólido extracraneal infantil que se asocia con una serie de cambios genéticos. En estas alteraciones genéticas se incluyen mutaciones en el dominio quinasa del receptor tirosina quinasa (RTK) del linfoma quinasa anaplásico (ALK), que se han encontrado tanto en el neuroblastoma somático como en el familiar. En consecuencia, para tratar a los pacientes se requiere la caracterización de estas mutaciones en términos de su respuesta a los inhibidores de la tirosina quinasa ALK (TKI). Aquí, informamos la identificación y caracterización de dos nuevas mutaciones ALK del neuroblastoma (A1099T y R1464STOP), que hemos investigado junto con varias mutaciones ALK previamente informadas pero no caracterizadas (T1087I, D1091N, T1151M, M1166R, F1174I y A1234T). Para comprender el papel potencial de estas mutaciones ALK en la progresión del neuroblastoma, hemos empleado sistemas basados ​​en cultivos celulares junto con el organismo modelo. Drosophila como lectura de la actividad independiente del ligando. La mutación de ALK en la posición 1174 (F1174I) genera un receptor de ganancia de función capaz de activar dianas intracelulares como ERK (quinasa regulada por señales extracelulares) y STAT3 (transductor de señal y activador de la transcripción 3) de manera independiente del ligando. El análisis de estos mutantes ALK previamente no caracterizados y la comparación con los mutantes ALK F1174 sugiere que las mutaciones ALK observadas en el neuroblastoma se dividen en tres clases. Estas clases son: (i) mutaciones independientes del ligando de ganancia de función tales como ALK F1174l, (ii) mutantes ALK muertas por quinasa, p. ALK I1250T (Schönherr et al., 2011a) y (iii) mutaciones ALK que son de naturaleza dependiente de ligando.Independientemente de la naturaleza de los mutantes ALK observados, en todos los casos la actividad de los receptores ALK mutantes podría ser anulada por el inhibidor de ALK crizotinib (Xalkori / PF-02341066), aunque con diferentes niveles de sensibilidad.


CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS

Los avances recientes en el estudio de la poli (ADP-ribosil) ación están relacionados principalmente con el papel biológico y el modo de funcionamiento de las proteínas pertenecientes a la familia PARP, así como con diferentes funciones de la poli (ADP-ribosil) ación en las células. El papel clave de este proceso en las células de mamíferos ha estimulado la publicación de excelentes revisiones (111-113) y números de revistas [Mol Aspects Med. 2013 34 (6)] dedicado a PARP y poli (ADP-ribosil) ación, así como a inhibidores de PARP. Al mismo tiempo, el mecanismo molecular de este proceso, que es importante para comprender el papel desempeñado por la mono y poli (ADP-ribosil) ación en la regulación de la replicación, la transcripción, la reparación del ADN y la estabilidad / degradación de las proteínas, sigue sin estar claro para un gran número de personas. grado. Todos estos eventos tienen que ser regulados por interacciones proteína-ADN y proteína-proteína, así como por interacciones de proteínas con poli (ADP-ribosa). Se sabe que la función de las proteínas de unión a ARN también depende de PARP y poli (ADP-ribosil) ación (27, 114).

La acción combinada de PARP1 y PARP2 parece importante en la regulación de la poli (ADP-ribosil) ación de proteínas (43, 115) y la poli (ADP-ribosil) ación recientemente descubierta del ADN dañado (32, 33, 116, 117). PARP3 junto con otros miembros de la familia PARP que catalizan la mono (ADP-ribosil) ación pueden contribuir al inicio de la síntesis de PAR en condiciones específicas (117). Es muy probable que la síntesis de polímeros PAR cortos o largos y ramificados pueda realizar diferentes funciones durante la regulación de procesos celulares. La síntesis de cadenas de PAR ramificadas podría servir principalmente para la creación de compartimentos celulares no membranosos mediante eventos de desmezcla de líquidos inducidos por PAR (84) necesarios para la regulación de la remodelación de la cromatina y los posteriores procesos multienzimáticos de reparación y transcripción del ADN. En este sentido, la acción combinada de mono, oligo y poli (ADP-ribosil) -transferasas en la célula puede asegurar una regulación multinivel del metabolismo del ADN y del ARN.

Dado que el ADN dañado no es el único activador de PARP1 (85), se puede suponer que se necesitan mecanismos más complicados para una activación bien ajustada y la precisión del proceso de ribosilación de ADP. De hecho, estudios recientes han revelado una serie de proteínas que no solo pueden estimular o inhibir la actividad catalítica de PARP1, sino que también parecen regular el objetivo y la longitud de PAR. Dado que la inhibición de PARP es muy prometedora en la terapia del cáncer, la elucidación de los matices del mecanismo de PARilación, así como los mecanismos moleculares de activación y regulación de la síntesis de PAR en las células, pueden proporcionar una base para el desarrollo racional de nuevas estrategias de tratamiento.

El objetivo de esta revisión fue resumir el conocimiento actual sobre el mecanismo molecular de la poli (ADP-ribosil) ación catalizada con PARP1 y su regulación para avanzar más en nuestro estudio de este proceso clave en células de mamíferos.