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6.2: Aislamiento, cultivo e identificación de virus - Biología


Objetivos de aprendizaje

  • Analizar por qué los virus se describieron originalmente como agentes filtrables.
  • Describir el cultivo de virus y la recolección y manipulación de muestras.
  • Comparar las técnicas in vivo e in vitro utilizadas para cultivar virus.

Al comienzo de este capítulo, describimos cómo se utilizaron filtros de Chamberland de porcelana con poros lo suficientemente pequeños como para permitir el paso de virus para descubrir el TMV. En la actualidad, los filtros de porcelana se han reemplazado por filtros de membrana y otros dispositivos que se utilizan para aislar e identificar virus.

Aislamiento de virus

A diferencia de las bacterias, muchas de las cuales pueden cultivarse en un medio nutritivo artificial, los virus requieren una célula huésped viva para su replicación. Las células huésped infectadas (eucariotas o procariotas) se pueden cultivar y hacer crecer, y luego se puede recolectar el medio de crecimiento como fuente de virus. Los viriones en el medio líquido se pueden separar de las células huésped mediante centrifugación o filtración. Los filtros pueden eliminar físicamente cualquier cosa presente en la solución que sea más grande que los viriones; los virus se pueden recolectar en el filtrado (Figura ( PageIndex {1} )).

Ejercicio ( PageIndex {1} )

¿Qué tamaño de poro de filtro se necesita para recolectar un virus?

Cultivo de virus

Los virus se pueden cultivar in vivo (dentro de todo un organismo vivo, planta o animal) o in vitro (fuera de un organismo vivo en células en un entorno artificial, como un tubo de ensayo, un matraz de cultivo celular o una placa de agar). Los bacteriófagos se pueden cultivar en presencia de una capa densa de bacterias (también llamada césped bacteriano) en un agar blando al 0,7% en una placa de Petri o en un matraz plano (horizontal) (Figura ( PageIndex {2a} )). La concentración de agar se reduce del 1,5% que se utiliza habitualmente en el cultivo de bacterias. El agar blando al 0,7% permite que los bacteriófagos se difundan fácilmente a través del medio. Para los bacteriófagos líticos, la lisis de los huéspedes bacterianos se puede observar fácilmente cuando se detecta una zona clara llamada placa (Figura ( PageIndex {1b} )). A medida que el fago mata a las bacterias, se observan muchas placas entre el césped bacteriano turbio.

Los virus animales requieren células dentro de un animal huésped o células de cultivo de tejidos derivadas de un animal. El cultivo de virus animales es importante para 1) identificación y diagnóstico de virus patógenos en muestras clínicas, 2) producción de vacunas y 3) estudios de investigación básica. Las fuentes de hospedadores in vivo pueden ser un embrión en desarrollo en un huevo de ave embrionado (por ejemplo, pollo, pavo) o un animal completo. Por ejemplo, la mayor parte de la vacuna contra la influenza fabricada para los programas anuales de vacunación contra la influenza se cultiva en huevos de gallina.

El embrión o animal huésped sirve como incubadora para la replicación viral (Figura ( PageIndex {3} )). La ubicación dentro del embrión o del animal huésped es importante. Muchos virus tienen un tropismo tisular y, por lo tanto, deben introducirse en un sitio específico para su crecimiento. Dentro de un embrión, los sitios diana incluyen la cavidad amniótica, la membrana corioalantoidea o el saco vitelino. La infección viral puede dañar las membranas de los tejidos, produciendo lesiones llamadas viruela; interrumpir el desarrollo embrionario; o provocar la muerte del embrión.

Para estudios in vitro, se pueden usar varios tipos de células para apoyar el crecimiento de virus. Un cultivo de células primarias se prepara recientemente a partir de órganos o tejidos animales. Las células se extraen de los tejidos mediante raspado mecánico o picado para liberar células o mediante un método enzimático que utiliza tripsina o colagenasa para romper el tejido y liberar células individuales en suspensión. Debido a los requisitos de dependencia del anclaje, los cultivos de células primarias requieren un medio de cultivo líquido en una placa de Petri o un matraz de cultivo de tejidos para que las células tengan una superficie sólida, como vidrio o plástico, para la unión y el crecimiento. Los cultivos primarios suelen tener una vida útil limitada. Cuando las células de un cultivo primario experimentan mitosis y se produce una densidad suficiente de células, las células entran en contacto con otras células. Cuando se produce este contacto de célula a célula, se activa la mitosis para que se detenga. Esto se llama inhibición por contacto y evita que la densidad de las células sea demasiado alta. Para evitar la inhibición por contacto, las células del cultivo celular primario deben transferirse a otro recipiente con medio de crecimiento fresco. A esto se le llama cultivo celular secundario. Periódicamente, la densidad celular debe reducirse vertiendo algunas células y agregando medio fresco para proporcionar espacio y nutrientes para mantener el crecimiento celular. A diferencia de los cultivos de células primarias, las líneas celulares continuas, generalmente derivadas de células transformadas o tumores, a menudo pueden subcultivarse muchas veces o incluso crecer indefinidamente (en cuyo caso se denominan inmortales). Las líneas celulares continuas pueden no exhibir dependencia de anclaje (crecerán en suspensión) y pueden haber perdido su inhibición por contacto. Como resultado, las líneas celulares continuas pueden crecer en montones o bultos que se asemejan a pequeños crecimientos tumorales (Figura ( PageIndex {4} )).

Un ejemplo de una línea celular inmortal es la línea celular HeLa, que se cultivó originalmente a partir de células tumorales obtenidas de Henrietta Lacks, una paciente que murió de cáncer de cuello uterino en 1951. Las células HeLa fueron la primera línea celular continua de cultivo de tejidos y se utilizaron para establecer el cultivo de tejidos como una tecnología importante para la investigación en biología celular, virología y medicina. Antes del descubrimiento de las células HeLa, los científicos no podían establecer cultivos de tejidos con fiabilidad o estabilidad. Más de seis décadas después, esta línea celular sigue viva y se utiliza para la investigación médica. Vea The Immortal Cell Line of Henrietta Lacks para leer más sobre esta importante línea celular y los controvertidos medios por los que se obtuvo.

Ejercicio ( PageIndex {2} )

¿Qué propiedad de las células hace necesarias diluciones periódicas de cultivos de células primarias?

LA LÍNEA CELULAR INMORTAL DE HENRIETTA FALTA

En enero de 1951, Henrietta Lacks, una mujer afroamericana de 30 años de Baltimore, fue diagnosticada con cáncer de cuello uterino en el Hospital John Hopkins. Ahora sabemos que su cáncer fue causado por el virus del papiloma humano (VPH). Los efectos citopáticos del virus alteraron las características de sus células en un proceso llamado transformación, que le da a las células la capacidad de dividirse continuamente. Esta capacidad, por supuesto, resultó en un tumor canceroso que finalmente mató a la Sra. Lacks en octubre a los 31 años. Antes de su muerte, se tomaron muestras de sus células cancerosas sin su conocimiento o permiso. Las muestras finalmente terminaron en posesión del Dr. George Gey, investigador biomédico de la Universidad Johns Hopkins. Gey pudo cultivar algunas de las células de la muestra de Lacks, creando lo que hoy se conoce como la línea celular inmortal HeLa. Estas células tienen la capacidad de vivir y crecer indefinidamente y, incluso hoy, todavía se utilizan ampliamente en muchas áreas de investigación.

Según el esposo de Lacks, ni Henrietta ni la familia dieron permiso al hospital para recolectar su muestra de tejido. De hecho, la familia no supo hasta 20 años después de la muerte de Lacks que sus células aún estaban vivas y se estaban utilizando activamente con fines comerciales y de investigación. Sin embargo, las células HeLa han sido fundamentales en numerosos descubrimientos de investigación relacionados con la poliomielitis, el cáncer y el SIDA, entre otras enfermedades. Las células también se han comercializado, aunque nunca se han patentado. A pesar de esto, el patrimonio de Henrietta Lacks nunca se ha beneficiado del uso de las células, aunque, en 2013, la familia Lacks recibió el control de la publicación de la secuencia genética de sus células.

Este caso plantea varias cuestiones bioéticas relacionadas con el consentimiento informado de los pacientes y el derecho a saber. En el momento en que se tomaron los tejidos de Lacks, no existían leyes ni directrices sobre el consentimiento informado. ¿Significa eso que fue tratada justamente en ese momento? Ciertamente, según los estándares actuales, la respuesta sería no. La extracción de tejidos u órganos de un paciente moribundo sin consentimiento no solo se considera poco ético sino ilegal, independientemente de que tal acto pueda salvar la vida de otros pacientes. ¿Es ético, entonces, que los científicos sigan utilizando los tejidos de Lacks para la investigación, a pesar de que fueron obtenidos ilegalmente según los estándares actuales?

Éticos o no, las celdas de Lacks se utilizan ampliamente hoy en día para tantas aplicaciones que es imposible enumerarlas todas. ¿Es este un caso en el que el fin justifica los medios? ¿Le agradaría a Lacks conocer su contribución a la ciencia y los millones de personas que se han beneficiado? ¿Querría ella que se compensara a su familia por los productos comerciales que se han desarrollado utilizando sus células? ¿O se sentiría violada y explotada por los investigadores que tomaron parte de su cuerpo sin su consentimiento? Como nunca le preguntaron, nunca lo sabremos.

Detección de un virus

Independientemente del método de cultivo, una vez que se ha introducido un virus en todo un organismo huésped, embrión o célula de cultivo de tejidos, se puede preparar una muestra a partir del huésped, embrión o línea celular infectada para su posterior análisis en un campo claro, electrones , o microscopio fluorescente. Los efectos citopáticos (CPE) son anomalías celulares observables distintas debido a una infección viral. Los CPE pueden incluir pérdida de adherencia a la superficie del recipiente, cambios en la forma celular de plana a redonda, encogimiento del núcleo, vacuolas en el citoplasma, fusión de membranas citoplasmáticas y formación de sincitios multinucleados, cuerpos de inclusión en el núcleo o citoplasma. y completar la lisis celular (ver Figura ( PageIndex {6} )).

Otros cambios patológicos incluyen la alteración viral del genoma del huésped y la alteración de las células normales en células transformadas, que son los tipos de células asociados con carcinomas y sarcomas. El tipo o la gravedad del ECP depende del tipo de virus involucrado. La figura ( PageIndex {6} ) enumera los CPE para virus específicos.

Mire este video para conocer los efectos de los virus en las células.

Ensayo de hemaglutinación

Se utiliza un ensayo serológico para detectar la presencia de ciertos tipos de virus en el suero del paciente. El suero es la fracción líquida de color pajizo del plasma sanguíneo del que se han eliminado los factores de coagulación. El suero se puede utilizar en un ensayo directo llamado ensayo de hemaglutinación para detectar tipos específicos de virus en la muestra del paciente. La hemaglutinación es la aglutinación (agrupamiento) de eritrocitos (glóbulos rojos). Muchos virus producen proteínas de superficie o picos llamados hemaglutininas que pueden unirse a receptores en las membranas de los eritrocitos y hacer que las células se aglutinen. La hemaglutinación es observable sin usar el microscopio, pero este método no siempre diferencia entre partículas virales infecciosas y no infecciosas, ya que ambas pueden aglutinar eritrocitos.

Para identificar un virus patógeno específico mediante hemaglutinación, debemos utilizar un enfoque indirecto. Las proteínas llamadas anticuerpos, generadas por el sistema inmunológico del paciente para combatir un virus específico, se pueden usar para unirse a componentes como las hemaglutininas que se asocian de manera única con tipos específicos de virus. La unión de los anticuerpos con las hemaglutininas que se encuentran en el virus evita posteriormente que los eritrocitos interactúen directamente con el virus. Entonces, cuando se agregan eritrocitos a los virus recubiertos de anticuerpos, no hay apariencia de aglutinación; se ha inhibido la aglutinación. A estos tipos de ensayos indirectos los denominamos ensayos de inhibición de la hemaglutinación (HAI) de anticuerpos específicos de virus. La HAI se puede utilizar para detectar la presencia de anticuerpos específicos para muchos tipos de virus que pueden estar causando o haber causado una infección en un paciente incluso meses o años después de la infección (consulte la Figura ( PageIndex {7} )). Este ensayo se describe con mayor detalle en Ensayos de aglutinación.

Ejercicio ( PageIndex {3} )

¿Cuál es el resultado de una prueba HIA positiva?

Prueba de amplificación de ácidos nucleicos

Las pruebas de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) se utilizan en biología molecular para detectar secuencias únicas de ácidos nucleicos de virus en muestras de pacientes. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una NAAT que se utiliza para detectar la presencia de ADN viral en la muestra de tejido o fluido corporal de un paciente. La PCR es una técnica que amplifica (es decir, sintetiza muchas copias) de un segmento de ADN viral de interés. Mediante la PCR, las secuencias de nucleótidos cortas llamadas cebadores se unen a secuencias específicas de ADN viral, lo que permite la identificación del virus.

La transcriptasa inversa-PCR (RT-PCR) es una NAAT que se utiliza para detectar la presencia de virus de ARN. La RT-PCR se diferencia de la PCR en que la enzima transcriptasa inversa (RT) se usa para producir un ADNc a partir de la pequeña cantidad de ARN viral en la muestra. A continuación, el ADNc puede amplificarse mediante PCR. Tanto la PCR como la RT-PCR se utilizan para detectar y confirmar la presencia del ácido nucleico viral en las muestras de pacientes.

ASUSTO DEL VPH

Michelle, una estudiante de enfermería de 21 años, llegó a la clínica de la universidad preocupada de haber estado expuesta a una enfermedad de transmisión sexual (ETS). Su pareja sexual había desarrollado recientemente varios bultos en la base de su pene. Había pospuesto ir al médico, pero Michelle sospecha que son verrugas genitales causadas por el VPH. Está especialmente preocupada porque sabe que el VPH no solo causa verrugas, sino que es una causa importante de cáncer de cuello uterino. Ella y su pareja siempre usan condones como método anticonceptivo, pero no está segura de que esta precaución la proteja del VPH.

El médico de Michelle no encuentra signos físicos de verrugas genitales o cualquier otra ETS, pero recomienda que Michelle se haga una prueba de Papanicolaou junto con una prueba de VPH. La prueba de Papanicolaou detectará células cervicales anormales y los CPE asociados con el VPH; la prueba del VPH comprobará la presencia del virus. Si ambas pruebas son negativas, Michelle puede estar más segura de que lo más probable es que no se haya infectado con el VPH. Sin embargo, su médico sugiere que sería prudente que Michelle se vacunase contra el VPH para protegerse de una posible exposición futura.

Ejercicio ( PageIndex {4} )

¿Por qué el médico de Michelle ordena dos pruebas diferentes en lugar de depender de una u otra?

Inmunoensayo enzimático

Los inmunoensayos enzimáticos (EIA) se basan en la capacidad de los anticuerpos para detectar y unirse a biomoléculas específicas llamadas antígenos. El anticuerpo de detección se adhiere al antígeno diana con un alto grado de especificidad en lo que podría ser una mezcla compleja de biomoléculas. También se incluye en este tipo de ensayo una enzima incolora unida al anticuerpo de detección. La enzima actúa como una etiqueta en el anticuerpo de detección y puede interactuar con un sustrato incoloro, lo que lleva a la producción de un producto final coloreado. Los EIA a menudo se basan en capas de anticuerpos para capturar y reaccionar con antígenos, todos los cuales están unidos a un filtro de membrana (consulte la Figura ( PageIndex {8} )). Los EIA para antígenos virales se utilizan a menudo como pruebas de detección preliminares. Si los resultados son positivos, la confirmación adicional requerirá pruebas con una sensibilidad aún mayor, como un western blot o un NAAT. Las EIA se analizan con más detalle en las EIA y ELISA.

Ejercicio ( PageIndex {5} )

¿Qué indica típicamente una prueba de EIA positiva?

PARTE 3

Junto con el análisis de RT / PCR, también se recogió la saliva de David para el cultivo viral. En general, ninguna prueba de diagnóstico es suficiente para el diagnóstico ante mortem, ya que los resultados dependerán de la sensibilidad del ensayo, la cantidad de viriones presentes en el momento de la prueba y el momento del ensayo, ya que la liberación de viriones en la saliva. puede variar. Resulta que el resultado fue negativo para el cultivo viral de la saliva. Esto no sorprende al médico de David, porque un resultado negativo no es una indicación absoluta de la ausencia de infección. Puede ser que el número de viriones en la saliva sea bajo en el momento del muestreo. No es inusual repetir la prueba a intervalos para mejorar la posibilidad de detectar cargas de virus más altas.

Ejercicio ( PageIndex {6} )

¿Debería el médico de David modificar su curso de tratamiento en función de los resultados de estas pruebas?

Resumen

  • El cultivo viral requiere la presencia de alguna forma de célula huésped (organismo completo, embrión o cultivo celular).
  • Los virus se pueden aislar de las muestras mediante filtración.
  • El filtrado viral es una rica fuente de viriones liberados.
  • Los bacteriófagos se detectan por la presencia de claras placas sobre césped bacteriano.
  • Los virus animales y vegetales son detectados por efectos citopáticos, técnicas moleculares (PCR, RT-PCR), inmunoensayos enzimáticos y ensayos serológicos (ensayo de hemaglutinación, ensayo de inhibición de hemaglutinación).

Contribuyente

  • Nina Parker, (Shenandoah University), Mark Schneegurt (Wichita State University), Anh-Hue Thi Tu (Georgia Southwestern State University), Philip Lister (Central New Mexico Community College) y Brian M. Forster (Saint Joseph's University) con muchos autores contribuyentes. Contenido original a través de Openstax (CC BY 4.0; acceso gratuito en https://openstax.org/books/microbiology/pages/1-introduction)


Aislamiento, cultivo e identificación del virus de la influenza A

Los virus de la influenza A (IAV) causan epidemias y pandemias que resultan en una carga financiera considerable y la pérdida de vidas humanas. Para gestionar las epidemias anuales de IAV y prepararse para futuras pandemias, se necesita con urgencia una mejor comprensión de cómo surgen, transmiten, causan enfermedades y adquieren potencial pandémico. Las técnicas fundamentales esenciales para adquirir dicho conocimiento son el aislamiento y el cultivo de IAV a partir de muestras experimentales y de vigilancia. Aquí presentamos un protocolo detallado para la recolección y procesamiento de muestras de IAV, amplificación en huevos de gallina o células de mamíferos e identificación de muestras que contienen patógenos desconocidos. Este protocolo es sólido y permite la generación de cultivos de virus que se pueden utilizar para análisis posteriores. Una vez que se obtienen las muestras experimentales o de vigilancia, se pueden generar cultivos de virus y se puede verificar la presencia de IAV en 3-5 días mediante el ensayo de transcripción inversa (RT) -PCR o hemaglutinación. Es posible que se requieran mayores plazos para el personal de laboratorio con menos experiencia o cuando se procesen grandes cantidades de muestras.

Declaracion de conflicto de interes

INTERESES FINANCIEROS COMPETENTES

Los autores declaran que no tienen intereses económicos en competencia.

Cifras

Figura 1. Aislamiento, cultura e identificación de IAV ...

Figura 1. Diagrama de flujo del protocolo de aislamiento, cultivo e identificación de IAV

Se indican las partes y subcomponentes del protocolo ...

Figura 2. Inoculación de huevos embrionados y alantoideo ...

Figura 2. Inoculación de huevos embrionados y recolección de líquido alantoideo

(A) Una sección longitudinal gráfica de…

Figura 3. Efectos citopáticos inducidos por IAV (CPE) en…

Figura 3. Efectos citopáticos inducidos por IAV (CPE) en células MDCK

Las células MDCK se infectaron de forma simulada (con MEM-BSA ...

Figura 4. Ensayo de hemaglutinación (HA)

Figura 4. Ensayo de hemaglutinación (HA)

(A) Muestras que carecen de actividad aglutinante (panel izquierdo) o que contienen IAV…

El ARN se extrajo de las reservas de virus CA04 (H1N1), K173 (H1N1),…

274 nt) se indica con una barra a la derecha, los tamaños de los patrones de ADN de doble hebra se indican a la izquierda (Nt = nucleótidos) y las descripciones de las pistas, que indican el ARN del virus de plantilla de entrada, se proporcionan a la derecha del panel del gel. (B) Se muestran los gráficos de RT-PCR Rn / Ct en tiempo real para cada molde de virus. (C) El gráfico muestra el valor Ct para cada una de las reacciones trazadas en el panel (B). La línea roja punteada indica el umbral para la identificación de una muestra positiva (el valor Ct de la muestra debe estar por debajo de esta línea para que se considere con seguridad "positivo").


Aislamiento, ensayo y cultivo de virus

Los virus se aíslan de células huésped infectadas que contienen viriones maduros. Las células se rompen mecánicamente y el contenido de las células se libera en una solución tampón adecuada. La suspensión que contiene los viriones y los ingredientes celulares se somete luego a centrifugación varias veces a diferentes velocidades para fraccionar los viriones de otros componentes celulares. Dicho procedimiento se conoce como centrifugación diferencial.

Una técnica más refinada es la centrifugación en gradiente de densidad que generalmente se aplica para obtener una muestra más purificada de virus. Antes de someter la muestra de virus a centrifugación en gradiente de densidad, se purifica inicialmente mediante centrifugación diferencial. Se prepara un gradiente de densidad en un tubo de centrífuga. Por ejemplo, un gradiente de sacarosa contiene una concentración de sacarosa que aumenta linealmente de arriba a abajo del tubo de centrífuga.

La muestra de virus parcialmente purificada se vierte en la parte superior y el tubo se somete a centrifugación a alta velocidad durante varias horas en una ultracentrífuga. La fuerza centrífuga empuja las partículas virales hacia el fondo hasta que se asientan en un gradiente de densidad de sacarosa que iguala al de los viriones, formando una zona o banda concentrada.

La suspensión de viriones se puede eliminar de esta banda con la ayuda de una pipeta. Los bacteriófagos que causan infecciones líticas pueden aislarse mediante un método más o menos similar mediante centrifugación diferencial del lisado para eliminar los restos celulares y las células intactas no lisadas de la bacteria huésped.

Ensayo de virus:

El ensayo viral significa la determinación del número de partículas virales por unidad de volumen de una muestra. Hay varios métodos disponibles para este propósito. El número total de partículas virales en una muestra, incluidos viriones viables y no viables, se puede contar directamente mediante microscopía electrónica.

Para ello, se mezcla un volumen conocido de una muestra purificada del virus con un volumen conocido de una suspensión de microesferas de látex de poliestireno de concentración conocida. La mezcla se rocía en gotitas sobre una membrana de soporte, se seca y se sombrea.

A partir de la relación entre el número de perlas y el de partículas virales, se puede calcular el número de viriones por unidad de volumen, cuando la preparación se examina con un microscopio electrónico. Por ejemplo, si en una preparación, una gota revela la presencia de 200 partículas virales y 20 perlas de látex, la concentración de viriones / ml sería 200/20 multiplicada por el número de perlas por ml en la suspensión.

Si la concentración de perlas en la suspensión original es de 5 x 10 10 por ml. El recuento viral sería 200/20 x 5 x 10 10 / ml = 5 x 10 11 / ml. La concentración de virus en una muestra también se conoce como título. Entre los otros métodos para analizar los títulos virales en una muestra, el método de la placa es muy importante.

Aprovecha la infectividad de los virus y su capacidad para destruir las células infectadas. El método de la placa se desarrolló primero para la detección y el recuento de bacteriófagos y luego se extendió al estudio de virus animales. El método de la placa se usa ampliamente por su simplicidad, precisión y reproducibilidad.

Para el ensayo de bacteriófagos, una muestra se diluye muchas veces (

10-20 a 10-25) y se mezcla con una gota de un cultivo líquido denso de la bacteria huésped y unos mililitros de medio de agar blando fundido a 44 ° C. La mezcla se vierte sobre la superficie de un agar nutritivo duro ya solidificado en una placa y se extiende uniformemente para permitir que los fagos y las bacterias se distribuyan uniformemente.

La incubación durante la noche de las placas revela la presencia de una serie de áreas claras, conocidas como placas, en un césped de crecimiento continuo de la bacteria huésped. Las placas se forman debido a la infección y destrucción de las células huésped que producen las áreas claras. El número de placas es proporcional a la concentración del virus.

Cada placa es producida por una unidad formadora de placa (PFU). Por tanto, si se siembra una alícuota de 0,1 ml de una dilución 10-20 de la muestra de fago y se produce un promedio de 40 placas por placa, el título es 40 / 0,1 x 10 20 PFU / ml. Cabe señalar que el número de PFU no puede tomarse como igual al número de fagos, pero los dos son proporcionales entre sí.

El método de la placa con la modificación necesaria también se ha utilizado para el ensayo de virus animales. En lugar de bacterias, se utiliza como huésped una suspensión de células animales cultivadas. El medio nutritivo bacteriológico se reemplaza por un medio nutritivo apropiado para el cultivo de células animales.

Como en el caso del ensayo de bacteriófagos, la muestra viral se diluye en serie y se extienden alícuotas de diluciones apropiadas en monocapas de células de cultivo huésped que crecen sobre un soporte sólido, p. en un petridish. Se permite que los viriones se adhieran a las células huésped durante aproximadamente una hora, y luego se cubre la monocapa con un agar blando o algún otro medio gelificante para evitar la difusión horizontal libre de las partículas virales.

Las partículas de la progenie infecciosa liberadas por la lisis de las células infectadas permanecen más o menos localizadas para producir focos o placas. Las placas se pueden contar para determinar el título de infectividad de la muestra de virus. El desarrollo de placas visibles puede requerir de 1 a 2 días o incluso varias semanas, según el virus. Para facilitar la detección y el recuento de placas, puede ser necesario teñir la capa celular con un tinte como el rojo neutro que tiñe solo las células vivas, o un tinte como el azul tripán que tiñe solo las células muertas. La precisión del ensayo de placa depende del número de placas contadas.

Si se desarrollan demasiadas placas en un plato, algunas de ellas tienden a fusionarse. Como resultado, el recuento se vuelve más bajo de lo que debería ser. Muchos virus producen placas afiladas, mientras que otros producen placas con un margen difuso.

De nuevo, algunos virus producen placas grandes y otros pequeñas. Dependiendo de la naturaleza del virus que se va a analizar, la dilución se determinará en consecuencia para obtener resultados fiables. En el caso de los bacteriófagos, el número de placas en las placas es proporcional a la concentración del virus, es decir, la relación entre el número de placas y la concentración viral es lineal.

Otro método de ensayo de virus animales que se utilizó anteriormente y ahora prácticamente abandonado y reemplazado por el ensayo de placa es el ensayo de viruela. En este método, la muestra viral adecuadamente diluida se inocula en la capa epitelial de la membrana crioalantoidea (CAM) de un embrión de pollo en un huevo de gallina embrionado. Las lesiones de infección características, llamadas pústulas, aparecen después de un período de incubación de 36 a 72 h. Las picaduras son áreas opacas, generalmente blancas, y se pueden ubicar en el CAM transparente.

El método de la placa también puede modificarse adecuadamente para enumerar virus de plantas. Para este propósito, se aplica un volumen conocido de una muestra adecuadamente diluida del virus de la planta sobre la superficie de la hoja de una planta hospedante susceptible después de que la hoja ha sido dañada mecánicamente frotando suavemente la superficie con un abrasivo como el carborandum.

Después de la incubación durante varios días aparecen lesiones necróticas en la hoja. A partir del número de lesiones por unidad de área, el factor de dilución de la muestra viral aplicada y el volumen de inóculo, se puede calcular la concentración (título) del virus.

Cultivo de virus:

Como parásitos obligados, los virus no se pueden cultivar en medios artificiales inanimados como bacterias u hongos. Pueden multiplicarse solo en células vivas.

(i) Huevo embrionado:

Uno de los primeros, pero todavía un método común de cultivo de virus animales, es el uso de huevos de gallina fertilizados o huevos embrionados que contienen un embrión joven (de 6 a 12 días). Diferentes virus animales pueden multiplicarse en diferentes partes de dichos huevos.

Las diferentes partes de un huevo de gallina embrionado se muestran en la figura 6.33:

De las diferentes partes de un huevo embrionado, la cavidad alantoidea y la membrana corioalantoidea (CAM) se usan para cultivar la mayoría de los virus animales, aunque el saco vitelino y el embrión también se usan para ciertos virus. El CAM está inoculado para el crecimiento de los virus de la viruela. Las lesiones (pústulas) son manchas blancas grisáceas visibles. El virus de las paperas crece preferentemente en la cavidad alantoidea. El virus de la influenza y el virus de la rabia también crecen en la cavidad alantoidea.

Para la inoculación, la superficie del huevo se esteriliza con un agente esterilizante de superficies. Se perfora un orificio a través del caparazón y la membrana del caparazón y se introduce la suspensión viral en la parte adecuada a través de la aguja de una jeringa hipodérmica. Luego, el orificio se sella con parafina y el huevo inoculado se incuba durante 5 a 12 días.

(ii) Cultivos de células animales:

El desarrollo de métodos in vitro de cultivo de células animales ha mejorado enormemente la propagación de virus animales. Las células animales cultivadas han proporcionado técnicas cuantitativas para estudiar virus animales comparables a las aplicadas para estudiar virus bacterianos. Se pueden usar cultivos de diferente origen para cultivar virus específicos, porque así como todos los virus no pueden infectar y multiplicarse en todos los organismos hospedadores, tampoco todos los virus pueden propagarse en todos los cultivos celulares.

Las células animales cultivadas difieren en muchos aspectos de los cultivos de microorganismos. Una de las diferencias más importantes es que los cultivos celulares producidos a partir de tejidos normales generalmente no sobreviven en transferencias repetidas. Después de algún tiempo, no se dividen más y mueren. Estos cultivos celulares derivados de los tejidos del huésped se denominan cultivos primarios. Los cultivos primarios derivados de tejidos embrionarios pueden seguir creciendo durante más tiempo que los cultivos celulares procedentes de tejidos adultos.

Para establecer un cultivo primario, se trata un pequeño trozo de tejido del animal con tripsina para separar las células. La tripsina se elimina por centrifugación y las células se suspenden. La suspensión se coloca en un recipiente de vidrio o plástico junto con un medio líquido, como el medio Eagle & # 8217s.

En la incubación, las células se adhieren a la superficie del recipiente y se dividen mitóticamente para producir células hijas que se extienden como un crecimiento confluente continuo de una sola capa gruesa que cubre la superficie del recipiente (monocapa).

Los cultivos de células primarias en monocapas pueden inocularse con virus animales dando como resultado la formación de placas. De las placas, los virus se pueden recolectar y purificar. Pueden prepararse cultivos primarios a partir de diversos tejidos de diferentes animales. Los cultivos primarios comúnmente utilizados son el cultivo de células de riñón de mono Rhesus, el cultivo de células de fibrolasto de embrión de pollo, el cultivo de células de amnios humanos, etc.

Una de las limitaciones de los cultivos de células primarias es que tienen una vida relativamente corta y no pueden mantenerse indefinidamente en subcultivos, como los de microorganismos. Las células individuales pierden la capacidad de dividirse después de varias generaciones de células. La mayoría de los cultivos de células humanas pierden capacidad de división después de aproximadamente 50 duplicaciones.

A veces, sucede que un clon derivado de una célula normal de un cultivo primario adquiere la capacidad de crecer indefinidamente. Un clon de este tipo que tiene una capacidad de división ilimitada da lugar a una línea celular. Una línea celular derivada de un cultivo primario tiene una mayor longevidad que el cultivo primario de la madre, pero no es verdaderamente inmortal.

Durante la transferencia repetida de una línea celular, un clon de células transformadas puede originarse espontáneamente. Estas células son células cancerosas y pueden producir cáncer cuando se introducen en el animal adecuado. Estas células transformadas constituyen las líneas celulares permanentes. Pueden generarse líneas celulares permanentes directamente a partir de cultivos de tejidos malignos de huéspedes, o pueden producirse infectando cultivos de células normales con virus oncogénicos.

Las células de tales líneas celulares permanentes difieren en morfología, orientación celular y composición cromosómica de las células de cultivos primarios y de las líneas celulares derivadas de ellas. Se han generado diferentes líneas celulares permanentes a partir de diferentes tejidos y diferentes fuentes, p. Ej. cuello uterino humano, hígado, amnios, riñón de mono, riñón de hámster, tejido conectivo de ratón, etc. Una de las líneas celulares humanas permanentes más conocidas son las células HeLa derivadas del cáncer de cuello uterino de una mujer afroamericana llamada Henrietta Lacks.

(iii) Bacteriófagos:

El cultivo de bacteriófagos no presenta dificultad, ya que se multiplican en bacterias hospedadoras en crecimiento, ya sea en caldo o en medio solidificado. Cuando se agrega un inóculo que contiene un fago lítico a un cultivo bacteriano líquido en crecimiento activo, la turbidez disminuye y el cultivo se vuelve casi transparente debido a la lisis de las células. Al eliminar los restos celulares mediante centrifugación, se puede obtener una rica cosecha del bacteriófago.

Similarly, when a bacterial culture growing in a petridish is inoculated with a phage suspension, the bacteria may be completely lysed, except a few phage resistant colonies. If the number of bacteria far exceeds the number of phages in the inoculum, then individual plaques are formed.

When a temperate bacteriophage Is inoculated into a liquid culture of the appropriate host bacterium, the turbidity decreases transiently and then increases. In agar cultures, the temperate phages produce turbid plaques. Turbid plaques result because a small proportion of the host bacteria undergo the lytic cycle, while the rest enters into lysogenic relationship.

(iv) Plant Viruses:

Plant viruses are generally propagated by direct inoculation of susceptible host plants. Viral inoculum is introduced into the leaf cells by causing artificial mechanical injury, such as rubbing with an abrasive. The viral particles enter through the disrupted cell walls into the cytoplasm of leaf cells where they multiply.

Some viruses, like TMV, may multiply in such great numbers that the progeny TMV particles may account for as much as 10% of the dry weight of the infected tobacco leaves. By disruption of the plant cells and by differential centrifugation TMV can be isolated in mass.

In more recent times, some success has been obtained in cultivating plant viruses in plant protoplast cultures. For example, protoplasts prepared from tobacco leaf mesophyll cells can be infected with TMV. Some plant viruses, like the Rhabdovirus causing necrotic yellow disease of lettuce, can multiply both in the plant host as well as in the insect vector. Such viruses can be grown in the vector cell culture. Lettuce necrotic yellow virus has been successfully grown in monolayers of cell cultures derived from leaf hopper giving an yield of about 10,000 virions per cell.


Cardiovascular Infections

ADMINISTRACIÓN

One should attempt virus identification by viral cultures from the blood, stool, or throat washing. Acute and convalescent sera should be compared for serologic titer rise.

Bed rest and limitation in activities are recommended during the acute phase (because exercise intensifies the damage from myocarditis in experimental animals).

Anticongestive measures include the following: a.

Rapid-acting diuretics (furosemide or ethacrynic acid, 1 mg/kg, each one to three times a day).

Rapid-acting inotropic agents, such as dobutamine or dopamine, are useful in critically ill children.

Oxygen and bed rest are recommended. Use of a “cardiac chair” or “infant seat” relieves respiratory distress.

Digoxin may be given cautiously, using half of the usual digitalizing dose (see Table 27-5 ), because some patients with myocarditis are exquisitely sensitive to the drug.

Beneficial effects of high-dose gamma globulin (2 g/kg, over 24 hours) have been reported. The gamma globulin was associated with better survival during the first year after presentation, echo evidence of smaller LV diastolic dimension, and higher fractional shortening compared with the control group. Myocardial damage in myocarditis is mediated in part by immunologic mechanisms, and a high dose of gamma globulin is an immunomodulatory agent, shown to be effective in myocarditis secondary to Kawasaki disease.

Angiotensin-converting enzyme inhibitors, such as captopril, may prove beneficial in the acute phase (as demonstrated in animal experiments).

Arrhythmias should be treated aggressively and may require the use of IV amiodarone.

The role of corticosteroids is unclear at this time, except in the treatment of severe rheumatic carditis (see Chapter 20 ).

Specific therapies include antitoxin in diphtheritic myocarditis.


Isolation and Cultivation of Microorganisms

Microorganisms occur in natural environment like soil. They are mixed with several other forms of life. Many microbes are pathogenic. They cause a number of diseases with a variety of symptoms, depending on how they interact with the patient. The isolation and growth of suspected microbe in pure culture is essential for the identification and control the infectious agent.

The primary culture from natural source will normally be a mixed culture containing microbes of different kinds. But in laboratory, the various species may be isolated from one another. A culture which contains just one species of microorganism is called a pure culture. The process of obtaining a pure culture by separating one species of microbe from a mixture of other species, is known as isolation of the organisms.

Methods of Isolation:

There are special techniques employed to obtain pure cultures of microorganisms. In few cases it is possible to secure pure culture by direct isolation or direct transfer. This can be done only in those situations in which pure culture occurs naturally. Kinds of specimens taken for culturing will depend on the nature and habitat of microbes.

Different pathogens can be isolated from body tissues and fluids such as blood, urine, sputum, pus, faces, spinal fluid, bile, pleural fluids, stomach fluids etc. In the blood stream of a patient suffering with typhoid fever, the bacteria Salmonella typhosa may be present.

A pure culture of this bacterium may be obtained by drawing blood sample using a sterilized hypodermic syringe and treating the blood with anticoagulant such as heparin and potassium oxalate. The presence of the anticoagulant prevents the pathogenic microbe from entrapping in fibrin clot. The sample of the blood may be inoculated into a suitable medium.

Following isolation methods are employed to isolate microbes from mixed cultures:

This is most widely used method of isolation. The technique consists of pouring a suitable sterile medium into sterile petriplate and allowing the medium to solidify. By means of a sterile loope or straight needle or a sterile bent glass-rod a small amount of growth preferably from a broth culture or bacterial suspension is streaked back and forth across the surface of agar until about one third of the diameter of the plate has been covered.

The needle is then flamed and streaking in done at right angles to and across the first streak. This serves to drag bacteria out in a long line from the initial streak. When this streaking is completed the needle is again flamed and streaking is done at right angles to the second streak and parallel to the first.

It includes diluting of a mixture of microorganisms until only a few hundred bacteria are left in each millilitre of the suspension. A very small amount of the dilution is then placed in a sterile petriplateby means of a sterile loop or pipette. The melted agar medium is cooled to about 45°C and is poured into plate. The microorganism and agar are well mixed. When the agar is solidified the individual bacterium will be held in place and will grow to a visible colony.

This method is used for the microorganisms which cannot be easily isolated by streaking or plating method. Sometimes when several organisms are present in a mixture, with one organism predominating, the predominating form may be isolated by this method. For example, when raw milk is allowed to sour at room temperature it will, at the time of curding, have a mixture of microorganisms with high percentage of Streptococcus lactis.

If 1 ml of the sour milk is taken into a tube containing 9 ml. of sterile milk (in which no organisms are present) then 1 ml. of this mixture is transferred with a sterile pipette into a second tube of sterile milk and the procedure is repeated i.e. from second to third tube, third to fourth tube until a series of about 10 tubes are inoculated. By this serial dilution, the chances are that a pure culture of S. lactis will be obtained.

4. Enrichment Procedure:

This procedure involves the use of media and conditions of cultivation which favour the growth of the desired species. For example, when a man suffers with typhoid, the intestinal discharge posses small number of Salmonella typhosa when compared with E. coli and other forms.

It is almost impossible to isolate the typhoid organisms because they represent only a fraction of a per cent of the total microorganisms present. The media are therefore derived, which allow the rapid growth of the desired organisms, at the same time inhibiting the growth of other microorganisms.

This is one of the most ideal and difficult method of securing pure culture. In this method a suspension of the pure culture is placed on the under-side of a sterile cover-glass mounted over a moist chamber on the stage of the micros­cope.

While looking through the microscope, a single cell is removed with the help of sterile micropipette and transferred to a small drop of sterile medium on a sterile cover-glass and is mounted on a sterile hanging drop slide, which is then incubated at suitable temperature. If the single cell germinates in this drop, few cells are transferred into a tube containing sterile culture medium which is placed in the incubator to obtain pure culture originated from single cell.

The isolation of anaerobic microorganisms is very difficult. There are certain special techniques by which these organisms are isolated.

Cultivation of Microorganisms:

For cultivating microbes in laboratory, we require culture media. The various mixtures of nutritive substances used for the laboratory cultivation of microorganisms are collectively known as culture media. The culture media serve as soil in which bacteria are planted for the purpose of study.

Culture Media:

Culture media must contain all the essential nutrients required by the organism for its growth and reproduction. A suitable source of energy, building materials and growth factors must be supplied in adequate amounts.

So a culture medium must contain:

Since microorganisms show a considerable variation in their nutritional requirements, no single medium is suitable for growth of all of them.

The different types of culture media employed fall into three groups:

1. Defined or synthetic media:

These are the media prepared from chemical compounds. They are highly purified and specific, an investigator working in another laboratory can duplicate them.

2. Complex or non-synthetic media:

Media that are prepared from ingredients that have not been precisely defined. It contains hydrolysed proteins and vitamin extracts. This type of medium cannot be duplicated by another worker in another laboratory. Peptone is usually produced by boiling beef, by the hydrolysis of its protein. Casein peptone and milk peptone are also used in complex media as the source of amino acids and nitrogen.

All liquid media, whether complex or synthetic may be converted to solid media by adding either gelat in (a protein) or agar-agar, (a complex polysaccharide) extracted from red marine algae. The use of agar has an advantage. The most bacteria are unable to hydrolyze this molecule into more simple components. Since gelatin is a liquid at room temperature, the use agar allows the medium to remain in a solid form while microbes are growing on its surface.

These are used for the cultivation of viruses. For example, fertilized eggs incubated for 8 to 12 days are able to support the growth of many viruses.

In another classification culture media are grouped into following four types:

1. Natural media:

Includes substances occurring in nature, as 1) Milk 2) Eggs 3) Blood 4) Extract of plant and animal tissues.

2. Derived media:

Includes known substances but the chemical composition of each is unknown. Examples are 1. Nutrient broth (prepared by boiling beef to extract nutrients and adding an amino acid-nitrogen source.) 2. Nutrient agar 3. Nutrient gelatin.

3. Chemically defined media:

Exact chemical composition known.

4. Special media:

Include combinations of the other three types of media.

There are four categories of media used in laboratory:

They are prepared with ingredients that will enhance the growth of certain microbes. Enrichment media encourage the growth of the suspected pathogen so that it will become the most pre-dominant type of microbe in the culture. Two types of enrichment media are blood agar and chocolate agar.

They are prepared with ingredients that inhibit the growth of unwanted microbes which might be in the specimen. The inhibitor may be an antibiotic, salt or other chemical. Mixed culture of microbes originally grown in enrichment media may be inoculated into selective media to isolate the desired microbe.

They are designed to differentiate among microbes. Different bacterial species may produce dissimilar colony colours when grown on differential agar. While in differential broth cultures, the media change colour. Differential media are used to confirm the identity of a microbe that has already been isolated by culturing in enrichment and selective media.

They are used to propagate, or keep microbes growing for a long lime. Samples grown on these media may be taken for analysis. The most common propagation media are nutrient broth and agar.

Preparation of Media:

There are three main steps in the preparation of media:

(a) Preparation as solutions of chemicals and adjusting the pH.

(b) Dispensing the media, and

A broth is prepared by dissolving the appropriate amount of the components in distilled water and pH is adjusted by the addition of either dilute NaOH or Hcl. The broth is dispensed into clean rimless ‘Pyrex’ test tubes which are plugged with non-absorbant cotton wool plugs. The test tubes are placed in wire baskets which are covered with grease proof paper.

The media are sterilized by autoclaving at a temperature of 121 °C and a pressure of 151 b/in 2 for 15 minutes. But medium containing heat- sensitive substances are sterilized either by filtering the solution at room temperature, using bacteria-proof filter or by a process called Tyndallization.

In this method, the liquids are steamed for one hour a day on three consecutive days and the liquids are incubated at 25-30°C. During the first steaming, all the heat sensitive vegetative cells are killed, leaving only the spores. During the first incubation period, most of the spores germinate in to vegetative cells. These vegetative cells are killed by the second steam period.

In the second incubation period, the rest of the spores germinate into vegetative cells which are killed by the third steaming period. In this way, the liquids are sterilized without temperature rising above 100°C.

Maintenance of Pure Culture:

After obtaining the pure culture of a particular microbe, it may be grown and maintained as a pure culture in different ways:

1. The most common practice is to grow the culture on suitable medium until it reaches the stationary phase of growth, and then store in a refrigerator. If they are to be kept alive for a long period all culture must be transferred to a fresh sterile medium. Thus by successive transfer, a culture may be kept for an indefinite period.

2. A second method involves freezing of young culture and desiccating it under vaccum. The cells of a pure culture will remain viable for a long period of time if they are mixed with sterile blood serum, sterile skimmed milk, before freezing and drying. They dried cultures are kept in the sealed, evacuated tubes and are stored in cool places.

3. This method of maintaining pure culture is most suitable for spore forming species. The microorganisms are grown in pure culture in suitable media. A suspension of microorganisms is then transferred to cotton stoppered tubes of sterilized dry soil. The spores remain viable, though dormant, for long periods of time, in dry soil. The organism can be grown after a desired period, by transferring the soil into a suitable medium and incubating it under suitable temperature.


Inoculation of Live Animals

Live animal inoculation is a method used to cultivate viruses.

Objetivos de aprendizaje

Describe live animal innoculation

Conclusiones clave

Puntos clave

  • Live inoculation was first used on human volunteers for the study of yellow fever virus.
  • Animals of choice for cultivating viruses include monkeys, rabbits, guinea pigs, rats, hamsters, and mice.
  • Live animal inoculation requires an experienced personnel to perform various inoculation techniques.

Términos clave

  • latente: Existing or present but concealed or inactive.
  • oncogenesis: The formation and development of tumors
  • inoculación: The introduction of an antigenic substance or vaccine into the body to produce immunity to a specific disease.

Yellow fever virus: A micrograph of the yellow fever virus.

Viruses are obligate intracellular parasites and cannot grow on inanimate media. They need living cells for replication, which can be provided by inoculation in live animals among other methods used to culture viruses (cell culture or inoculation of embryonated eggs). Inoculation of human volunteers was the only known method of cultivation of viruses and understanding viral disease. In 1900, Reed and his colleagues used human volunteers for their work on yellow fever. Due to serious risk involved, human volunteers are recruited only when no other method is available and the virus is relatively harmless. Smallpox was likely the first disease people tried to prevent by purposely inoculating themselves with other infections and was the first disease for which a vaccine was produced. Today, studying viruses via the inoculation of humans would require a stringent study of ethical practices by an institutional review board.

In the past few decades, animal inoculation has been employed for virus isolation. The laboratory animals used include monkeys, rabbits, guinea pigs, rats, hamsters, and mice. The choice of animals and route of inoculation (intracerebral, intraperitoneal, subcutaneous, intradermal, or intraocular) depends largely on the type of virus to be isolated. Handling of animals and inoculation into various routes requires special experience and training. In addition to virus isolation, animal inoculation can also be used to observe pathogenesis, immune response, epidemiology, and oncogenesis. Growth of the virus in inoculated animals may be indicated by visible lesions, disease, or death. Sometimes, serial passage into animals may be required to obtain visible evidence of viral growth. Animal inoculation has several disadvantages as immunity may interfere with viral growth, and the animal may harbor latent viruses.


Definition of Bacterial Isolation

Bacterial isolation is defined as the technique of separating one species of bacteria from the bacteria’s mixed culture by different plating methods like pouring, spreading, streaking, and serial dilution. The growth of bacteria can be observed over the solid nutrient medium, in the liquid broth medium and some automated liquid culture medium. To visualize and isolate the bacteria in solid media, we need to add the bacterial suspension into or on the media.

Oppositely, the bacterial inoculum in the liquid broth is characterized by the turgid media. los automated liquid culture medium also detects bacteria’s presence through various characteristics like production of carbon dioxide. Therefore, bacterial isolation provides an important tool to study the morphological, physiochemical and pathogenic properties of the bacteria that has been isolated.


Isolation and characterization of SARS-CoV-2 from the first US COVID-19 patient

The etiologic agent of the outbreak of pneumonia in Wuhan China in January-2020, was identified as severe acute respiratory syndrome associated coronavirus 2 (SARS-CoV-2). The first US patient was diagnosed by the State of Washington and the US Centers for Disease Control and Prevention on January 20, 2020. We isolated virus from nasopharyngeal and oropharyngeal specimens, and characterized the viral sequence, replication properties, and cell culture tropism. We found that the virus replicated to high titers in Vero-CCL81 cells and Vero E6 cells in the absence of trypsin. We also deposited the virus into two virus repositories, making it broadly available to the public health and research communities. We hope that open access to this important reagent will expedite development of medical countermeasures.

Article Summary Scientists have isolated replication competent virus from the first US COVID-19 patient. The isolated virus described here will serve as the US reference strain to be used in research, drug discovery and vaccine testing.


Ver el vídeo: Cultivos celulares y diagnostico viral (Enero 2022).