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E. coli no crece en medio líquido

E. coli no crece en medio líquido



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Regularmente estamos haciendo transformación bacteriana y subcultivo de placa a medio líquido para extraer ADN. Esto generalmente va muy bien y es sencillo, pero ocasionalmente, las colonias que crecieron bien en una placa, no crecerán en cultivo líquido (con los mismos antibióticos que estaban en la placa). Esto le ha sucedido ahora a tres personas en múltiples plásmidos.

Por ejemplo, estaba tratando de ligar un gen de resistencia a la ampicilina (con su promotor) dentro del plásmido pENTR4 (que ya tenía resistencia a la kanamicina). Mi placa y LB contenían los dos antibióticos, pero las colonias solo logran ponerse ligeramente turbias a las 16 horas.

La contaminación por fagos es muy poco probable y el efecto no puede deberse a una toxicidad del fragmento insertado, ya que tanto el inserto como el vector se han cultivado en estas mismas bacterias varias veces sin problemas.

¿Ayudar?

EDIT1: usamos carbenicilina en lugar de ampicilina en la placa, pero no en el medio líquido.

EDIT2 - Después de lograr hacer crecer algunas colonias en líquido, logré obtener una pequeña cantidad del plásmido (el perfil fue bueno; concentración = 70ng / ul). Lo extraño es que cuando volví a transformar este ADN en la bacteria Stbl3, no tuve absolutamente ningún problema. ¿Crees que el stock de bacterias podría ser responsable?


Creo que hay más de una posibilidad para esto.

  1. Las placas que contienen colonias se almacenan durante demasiado tiempo en 4C (como sugirió @mdperry). Esto hace que las colonias pierdan el plásmido con el tiempo, ya que el antibiótico de la placa se degrada con el tiempo. Hay un estudio sobre esto y he compartido el enlace. (http://homepages.bw.edu/~mbumbuli/biotech/colin/index.html).
  2. El inserto es tóxico para las células y el promotor no es lo suficientemente fuerte. Hay una expresión con fugas que hace que las células mueran.
  3. Verifique las células competentes y su estado de almacenamiento, ya que afectaría en gran medida la eficiencia de la transformación. Realice una transformación simulada con plásmido simple sin inserto y extiéndalos en una placa de antibióticos.

Acumulación rápida de mutaciones que activan la motilidad en el cultivo líquido en reposo de Escherichia coli

La expresión de genes de motilidad es un proceso potencialmente beneficioso pero costoso en bacterias. Curiosamente, muchas cepas aisladas de Escherichia coli poseen genes de motilidad pero han perdido la capacidad de activarlos en condiciones en las que la motilidad es ventajosa, lo que plantea la cuestión de cómo responden a estas situaciones. A través del perfil transcriptómico de cepas en el E. coli colección de Keio knockout de un solo gen, notamos una drástica regulación positiva de los genes de motilidad en muchas de las cepas de deleción en comparación con los niveles en su cepa parental débilmente móvil (BW25113). Mostramos que este cambio a un fenotipo móvil no es una consecuencia directa de los genes eliminados, sino que se debe a una variedad de mutaciones secundarias que aumentan la expresión del principal regulador de la motilidad, FlhDC. Es importante destacar que encontramos que este cambio se puede reproducir al crecer con poca movilidad. E. coli se filtra en medio líquido sin agitación durante la noche, pero no en medio líquido con agitación. Los aislados individuales después de las incubaciones nocturnas sin agitación adquirieron mutaciones distintas aguas arriba del flhDC operón, que incluye diferentes elementos de la secuencia de inserción (IS) y, en menor medida, mutaciones puntuales. La rapidez con la que los cambios genéticos atraviesan las poblaciones que crecen sin temblar muestra que las cepas poco móviles pueden adaptarse rápidamente a un estilo de vida móvil mediante el recableado genético.IMPORTANCIA La capacidad de sintonizar la expresión génica en momentos de necesidad fuera de las redes reguladoras predeterminadas es un proceso evolutivo esencial que permite a los organismos sobrevivir y competir. Aquí, mostramos que tras la incubación durante la noche en medio líquido sin agitar, las poblaciones de Escherichia coli las bacterias pueden acumular rápidamente mutantes que tienen motilidad constitutiva. Este efecto contribuye a mutaciones secundarias generalizadas en la biblioteca de knockout de un solo gen, la colección Keio. Como resultado, 49/71 (69%) de las cepas Keio probadas exhibieron varios grados de motilidad, mientras que su cepa parental es escasamente móvil. Estas observaciones destacan la plasticidad de la expresión génica incluso en ausencia de programas regulatorios preexistentes y deberían crear conciencia sobre los procedimientos para el manejo de cepas de laboratorio de E. coli.

Palabras clave: Evolución de la colección Keio Regulación génica flagelar Regulación génica de la motilidad flagelar.

Copyright © 2019 Sociedad Estadounidense de Microbiología.

Cifras

Remodelación del transcriptoma entre las cepas Keio.…

Remodelación del transcriptoma entre cepas Keio. (A) Agrupación jerárquica de datos de expresión génica de…

Confirmación de la expresión del gen de la motilidad ...

Confirmación de la expresión del gen de la motilidad mediante un reportero de GFP impulsado por el fliC ...

Correlación entre la activación del gen de la motilidad ...

Correlación entre la activación del gen de la motilidad y el fenotipo de natación. (A) Ensayo de motilidad de natación en ...

Ausencia de activación de la motilidad después de ...

Ausencia de activación de la motilidad después de la transducción P1 de deleciones de un solo gen. (A) niveles de ARNm ...

Diversas mutaciones secundarias responsables de ...

Diversas mutaciones secundarias responsables de la activación de la motilidad en la colección Keio. (A) Mutaciones en ...

Acumulación rápida de mutaciones que activan la motilidad ...

Acumulación rápida de mutaciones que activan la motilidad en cultivo líquido en reposo. (A) Ensayo de natación en agar blando ...

Activación del gen de la motilidad en cepas ...

Activación del gen de la motilidad en cepas deficientes para aerotaxis y quimiotaxis. (A) Resultados de la transformación ...


Los ARN pequeños responden al estrés durante E. coli crecimiento en matraces de agitación

La mayor parte de la información sobre la participación de ARNs en respuesta a condiciones de crecimiento estresadas se obtuvo de E. coli creciendo a baja densidad en matraz de agitación. Los datos obtenidos de estos estudios identificaron varios ARNs que respondían al estrés, incluida la temperatura, la osmolaridad, la limitación de hierro, la acumulación de fosfato de glucosa, el pH y el oxígeno. Todos estos estudios se concentraron únicamente en comprender la respuesta molecular del sRNA al estrés, pero no en las posibles implicaciones fisiológicas de manipular la expresión de estos sRNA. La información actualmente conocida se resume en la Tabla 1.

Temperatura

Se identificaron dos ARNs, MicC y MicF, que participan en la regulación de la traducción y la estabilidad de las porinas [49]. Se encontró que ambos estaban asociados con la respuesta a los cambios de temperatura. MicC se expresó a baja temperatura (24 ° C) y se identificó al crecer E. coli K-12 (JM109) en LB y en medios mínimos de M9-glicerol a diferentes temperaturas en una fase estacionaria y en una exponencial a una DO600 de 0,2 o 0,4 [25]. Se encontró que MicF se expresaba a temperaturas más altas (37 o 42 ° C) y se identificó por crecimiento E. coli K-12 JA221 durante la noche a un OD550 de 0,2, seguido de un aumento de la temperatura de crecimiento a 37 ° C añadiendo un volumen igual de medio a 50 ° C [32]. Otro sRNA que responde al cambio de temperatura es DsrA, se encontró que este sRNA estaba inducido en mi. coli Cultivos K-12 cultivados en medio LB a 24 ° C hasta una DO600 de 0,4-0,6 [27]. DsrA es un ARNs que regula rpoS y hns ARNm [29]. Este sRNA interactúa con el mRNA del regulador transcripcional σ S (codificado por rpoS) y el represor transcripcional H-NS [50], activa la traducción de RpoS e inhibe hns traducción [29, 30].

Osmolaridad

El sRNA MicF, además de su respuesta al cambio de temperatura, también se ha asociado con condiciones de alta osmolaridad creadas al agregar un 20% de sacarosa al medio de crecimiento. La expresión de MicF aumentó cuando E. coli K-12 se cultivó en LB, medio bajo en fosfato o en caldo nutritivo o en medio M9 suplementado con glucosa al 0,4%, la expresión de MicF aumentó cuando el cultivo se expuso a condiciones de alta osmolaridad [26].

Otro sRNA que responde a los cambios en la osmolaridad es RprA, un sRNA de 105nt que activa la traducción de RpoS cuando las bacterias se exponen a un choque osmótico [33, 34]. Los experimentos se realizaron creciendo E. coli K-12 (MG1655) en LB a fase estacionaria (OD600 = 3,5) y la adición de sacarosa 0,12, 0,23, 0,46 o 1,0 M durante 20 min [34]. La expresión de RprA también ha sido inducida por choque osmótico en un E. coli Cepa K-12 MC1061 cultivada en LB hasta una DO600 de 0,3 añadiendo 0,46 M de sacarosa [33].

Concentración de hierro

Se encontró que la transcripción de RyhB, un ARNs de 90 nt, estaba asociada con la disponibilidad de hierro en los medios. RyhB generalmente se reprime en condiciones ricas en hierro [51] y se expresa cuando la concentración de hierro es baja, lo que reduce el consumo de hierro al regular a la baja la expresión de proteínas que contienen hierro y, como resultado, aumenta la concentración de Fe 3+ intracelular libre. [51, 52]. Esto se estudió mediante el uso de derivados de E. coli K-12 MG1655 que se cultivaron en medio M63 suplementado con FeSO 1 μM4 [52]. Otros estudios para acceder al efecto de la alta concentración de hierro se realizaron mediante el cultivo E. coli K-12 MG1655 a un diámetro exterior600 = 0.3 en medio LB o M63 suplementado con glicerol al 0.2% a 50 μM FeSO4 [35]. Estos mostraron que el aumento de la expresión de RyhB desencadenaba una expresión reducida de genes asociados con el ciclo de TCA y la cadena respiratoria, como acnA (aconitasa), sdhCDAB (succinato deshidrogenasa), sodB (superóxido dismutasa), fumA (fumarasa) y ferritinas bfr y ftnA [35, 36].

El sRNA GadY se ha relacionado con una mayor expresión de genes asociados con la respuesta a condiciones ácidas. Hay tres especies de ARNs de GadY: GadY de longitud completa a 105 nt y dos formas procesadas a 90 y 59 nt respectivamente, todas detectadas cuando E. coli K-12 MC4100 y E. coli Se cultivaron K-12 MG1655 en matraces de agitación en LB a pH 5,8 [45]. En un experimento diferente, GadY y sus formas procesadas se detectaron en E. coli crecido a OD600 de 2,0 en medio LB-MES tamponado a pH 5,5 con ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico (MES) 100 mM [46].

La sobreexpresión de GadY se asoció con la activación de los genes de resistencia a los ácidos. gadA, gadB, y gadC (parte del sistema GDS-glutamato descarboxilasa), que a su vez activó el ARNm de GadX, induciendo la expresión de GDS [45, 53, 54]. También se descubrió que GadY activa el sistema de lisina descarboxilasa (LDS) a pH 5,8 [55]. Otros dos ARNs, RprA y DsrA, se han asociado con resistencia a los ácidos [47]. El RprA y DsrA se expresaron cuando E. coli Se cultivaron células K-12 MG1655 en medio M9 suplementado con glucosa al 0,4%. El cultivo se diluyó 1:10 o 1: 100 con medio mínimo M9 suplementado con glucosa al 0,4% y glutamato 1,5 mmol / L, que se ajustó a pH 2,0 o 3,0 con HCl concentrado [47]. RprA induce la expresión de rpoS que protege contra la resistencia a los ácidos [47]. La sobreexpresión de DsrA induce rpoS de forma similar a la RprA sRNA [48].

Transporte de glucosa y acumulación de glucosa fosfato

Se encontró que la expresión del transportador de glucosa ptsG está regulada a nivel postranscripcional por el sRNA SgrS de 227 nt que se une al mRNA ptsG [40, 56]. El efecto de SgrS se observó cuando E. coli K-12 (MG1655) creció en placas de agar con medio mínimo M63 suplementadas con glucosa al 0,2% y en medio líquido LB suplementado con 1% de glucosa o la glucosa no metabolizada alfa metil glucósido (αMG) [40, 57]. Se estableció que SgrS se expresa en respuesta a la acumulación de glucosa-6-fosfato, inhibiendo la traducción de la ptsG ARNm y, como resultado, causa la disminución del transportador de glucosa IICB Glc y la entrada de glucosa en las células [58, 59, 60, 61]. SgrS también codifica el polipéptido SgrT de 43 aminoácidos que regula la actividad de los transportadores IICB Glc preexistentes [41]. Este polipéptido rescata las células que crecen en presencia de αMG reduciendo el transporte de glucosa independientemente de la degradación del ARNm [41, 62]. Otros ARNs que están asociados con el metabolismo del carbono son CyaR y Spot42. CyaR, un ARNs de 87 nt, se induce a concentraciones bajas de glucosa y está regulado positivamente por el regulador global Crp [42]. Esto fue estudiado creciendo E. coli en matraces de agitación o placas de agar que contienen caldo Lennox o medio mínimo M63 suplementado con 0,001% de vitamina B1 y 0,2% de glucosa o glicerol [42]. La sobreexpresión de CyaR reguló negativamente al menos 25 genes adicionales, responsables de la expresión de proteínas de membrana, transportadores y enzimas esenciales para adaptar las células a condiciones de glucosa baja [42]. Spot42 es un ARNs dependiente de Hfq de 109 nt que reprime los genes implicados en el metabolismo central y secundario, el equilibrio redox y el consumo de diversas fuentes de carbono no preferidas, lo que da como resultado un crecimiento lento [63]. La información anterior se obtuvo aumentando E. coli K-12 en medio LB o M9 suplementado con 10 μg / mL de tiamina, MgSO 2 mM4, CaCl 0,1 mM2y 0,2% de casaminoácidos, y diferentes fuentes de carbono [63].

Oxígeno

El sRNA OxyS, se induce en respuesta a una mayor expresión del regulón OxyR que se desencadenó al exponer E. coli K-12, cultivado en medio LB hasta OD600 = 0,2, a H2O2 [37]. OxyS actúa postranscripcionalmente inhibiendo rpoS y regulando la expresión de FhlA (formato activador de hidrogeniasa) que protege a las células contra la mutagénesis [37, 64, 65].

Las altas concentraciones de oxígeno causan daño celular al afectar las enzimas, las proteínas y el ADN a través de la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS). E. coli está protegido contra el estrés oxidativo mediante la activación de los regulones SoxRS y OxyR [66, 67]. Cuando E. coli K-12, cultivado en LB o medio definido, está expuesto a fármacos de ciclo superóxido o redox, el regulón SoxR activa el soxS gen que actúa como factor de transcripción, induciendo la expresión de varios genes del regulón SoxRS. Algunos de los genes activados por la proteína SoxS son soda, acnA, fumC, micF, y zwf, reemplazando las enzimas sensibles como la aconitasa B y las fumarasas A y B por las isoenzimas resistentes al oxígeno aconitasa A y fumarasa C [68, 69].


Preparación de medios / medios de cultivo

Preparación del medio de cultivo | Autor de la imagen: SouravBio (microbiologynote.com)

Comercialmente, todos los medios están disponibles en forma de polvo. La preparación de medio de cultivo o medio bacteriológico se puede realizar mediante los siguientes pasos

  1. Disuelva los ingredientes deseados o el medio deshidratado completo en un volumen apropiado de agua destilada.
  2. Luego, determine el pH del medio usando un medidor de pH y ajústelo si es necesario.
  3. Agregue agar a este medio y hiérvalo para disolver el agar en caso de que se requiera un medio sólido.
  4. Luego se distribuyó el medio en tubos o matraces.
  5. Después de eso, los esterilizó usando un autoclave. Algunos medios termolábiles o ingredientes específicos se esterilizan mediante filtración.

La Tabla 2 muestra las características de las colonias de any y B en medio estable

A partir de los resultados experimentales, las colonias bacterianas de A se diseñaron con polos, gramnegativas y tenían un tipo de disposición aislada cuando se observaban al microscopio. Disfrutando de las características de la colonia, las colonias de A parecían redondas, incoloras, translúcidas, elevadas, lisas y poseían una colonia de mayor tamaño. Además, la parte superior de la colonia A era plana y tenía extremos enteros. Por lo tanto, a juzgar por las características de la colonia, la morfología y la naturaleza Gram de las bacterias, las bacterias de la colonia A podrían ser posiblemente E. coli. Por otro lado, las colonias de bacterias de B fueron Gram-positivas, moldeadas por cocos y con racimos de diseño en forma de uva. Las colonias de B eran de tamaño redondo, blanquecino, opaco, convexo, granular y puntiforme. Por tanto, las colonias de bacterias de B probablemente fueron S. epidermidis.

Nombre: Wei Xiao Yang


Cambios fenotípicos exhibidos por E. coli Cultivado en el espacio

Las bacterias acompañarán a los humanos en nuestra exploración del espacio, por lo que es importante estudiar su adaptación al entorno de microgravedad. Para investigar los posibles cambios fenotípicos de las bacterias que crecen en el espacio, Escherichia coli se cultivó a bordo de la Estación Espacial Internacional con controles combinados en la Tierra. Las muestras se desafiaron con diferentes concentraciones de sulfato de gentamicina para estudiar el papel de la concentración del fármaco en las variables dependientes del entorno espacial. Los análisis incluyeron evaluaciones del recuento celular final, tamaño celular, grosor de la envoltura celular, ultraestructura celular y morfología del cultivo. Se observó un aumento de 13 veces en el recuento celular final en el espacio con respecto a los controles terrestres y las células de vuelo espacial pudieron crecer en presencia de niveles normalmente inhibidores de sulfato de gentamicina. La microscopía de luz de contraste y la microscopía electrónica de barrido / haz de iones enfocado mostraron que, en promedio, las células en el espacio eran el 37% del volumen de sus controles emparejados, lo que puede alterar la tasa de interacciones molécula-célula en un régimen de transporte de masa de difusión limitada como se espera que ocurra en microgravedad. Las imágenes de TEM mostraron un aumento en el grosor de la envoltura celular de entre el 25 y el 43% en el espacio con respecto al grupo de control de la Tierra. Se observaron vesículas de la membrana externa en las muestras de vuelos espaciales, pero no en los cultivos terrestres. Tiempo E. coli Los cultivos en suspensión en la Tierra se distribuyeron homogéneamente por todo el medio líquido, en el espacio tendieron a formar un grupo, dejando el medio circundante visiblemente libre de células. Este comportamiento de agregación celular puede estar asociado con una mayor formación de biopelículas observada en otros experimentos de vuelos espaciales.

Palabras clave: agregación crecimiento bacteriano bioastronáutica envoltura celular tamaño celular microgravedad vesícula.

Cifras

Se muestra al astronauta de la NASA Rick Mastracchio ...

Se muestra al astronauta de la NASA Rick Mastracchio sosteniendo un GAP en su mano derecha y ...

En el espacio, E. coli células…

En el espacio, E. coli las células tenían 59% de longitud, 83% de diámetro y ...

Microscopía electrónica de barrido / haz de iones enfocado ...

Imagen de microscopía electrónica de barrido / haz de iones enfocado (FIB / SEM) de muestras desafiadas con 25 μg / mL…

En el espacio, grosor de la envoltura de la celda ...

En el espacio, el grosor de la envolvente celular aumentó en un 25 y un 43% en el 25 ...

Microscopía electrónica de transmisión de sección delgada (TEM) ...

Imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de sección delgada de E. coli . Izquierda : muestra…

Imágenes de contraste de fase de MI.…

Imágenes de contraste de fase de E. coli cultivado en la Tierra (imagen superior) y en ...


Resultados

La sobreexpresión de siete genes diferentes restaura el crecimiento de una cepa de E. coli que carece de PdxB en M9 / glucosa

PdxB cataliza el segundo paso en la vía de síntesis de PLP (Figura 1). Una cepa en la que pdxB se elimina no puede crecer en medio mínimo a 37 ° C porque no puede sintetizar PLP. Sin embargo, puede crecer lentamente a 30 ° C, lo que sugiere que se puede sintetizar suficiente PLP por una ruta diferente para permitir un crecimiento lento (Lam y Winkler, 1990). Llevamos a cabo un cribado de supresión de múltiples copias con la intención de identificar enzimas para las que la sobreproducción proporciona suficiente actividad promiscua 4PE deshidrogenasa para reemplazar PdxB. Una biblioteca de expresiones que contiene 3276 ORF de E. coli pero falta pdxB se ensambló utilizando plásmidos aislados de clones en la colección ASKA (Kitagawa et al, 2005) e introducido en un ΔpdxBkan cepa (en lo sucesivo denominada ΔpdxB cepa). Se recuperaron los plásmidos de 28 colonias que crecieron en M9 / glucosa y se identificó el ORF portado por cada una mediante secuenciación. Sorprendentemente, encontramos que la sobreexpresión de siete genes diferentes restauró el crecimiento de ΔpdxB tensión en M9 / glucosa (ver Tabla I, Figura complementaria 1 y Tabla complementaria II). (Como tres de los siete genes se encontraron solo una vez, es posible que la población no se muestreó correctamente y que aún quedan por descubrir genes adicionales que restauran el crecimiento). Tres de los siete genes (su b, php y yjbQ) permiten el crecimiento en medio líquido y sólido, los otros permiten el crecimiento solo en medio sólido.

Proteína Función
PdxA Fosfohidroxitreonina deshidrogenasa / descarboxilasa
AroB Sintasa de deshidroquinato
ThrB Homoserina quinasa
YeaB a a También conocido como NudL.
Hidrolasa NUDIX prevista
Su b Imidazol-glicerol-fosfato deshidratasa / histidinol fosfatasa
Php Metalohidrolasa prevista
YjbQ Desconocido

Solo dos de los siete genes que complementan el ΔpdxB cepa codifica enzimas que tienen actividad deshidrogenasa. La 4-hidroxi-L-treonina (4HT) deshidrogenasa (PdxA) cataliza una reacción de deshidrogenación aguas abajo de la reacción catalizada por PdxB. La deshidroquinato sintasa (AroB) cataliza una reacción compleja en la que el NAD + fuertemente unido se reduce y luego se oxida durante la conversión de varios pasos del ácido 3-desoxi-D-arabino-heptulosónico 7-fosfato en deshidroquinato (Carpenter et al, 1998). Se sabe o se predice que cuatro de las cinco enzimas restantes catalizan la deshidratación, la transferencia de fosforilo o reacciones hidrolíticas. YjbQ exhibe actividad de tiamina fosfato sintasa de bajo nivel (Morett et al, 2008), aunque no se cree que esta sea su función fisiológica.

Ensayos para la actividad 4PE deshidrogenasa en las siete enzimas diferentes que, cuando se sobreproducen, restauran el crecimiento de ΔpdxB tensión en la glucosa

La generación de un alto nivel de una enzima con actividad promiscua de 4PE deshidrogenasa es el mecanismo más obvio por el cual la sobreexpresión de un gen podría complementar la ΔpdxB cepa. Sin embargo, ThrB, YeaB, HisB y Php no mostraron oxidación de 4PE incluso después de una incubación prolongada. YjbQ no se pudo analizar porque era difícil obtener proteína soluble.

PdxA oxida 4PE lentamente, con un kgato de 0,020 ± 0,002 s −1, a KMETRO de 150 ± 13 μM y una kgato/KMETRO de 138 ± 19 M −1 s −1, medido por la siguiente reducción de NAD +. PdxB oxida 4PE en C-2. Esperábamos que PdxA oxidaría 4PE en C-3, en lugar de C-2, según una comparación de las estructuras de 4PE y 4-fosfohidroxitreonina (4PHT), el sustrato normal de PdxA (Figura 2A y B). Como la reacción es termodinámicamente cuesta arriba y el producto no se acumula en concentraciones suficientes para la caracterización por RMN, determinamos el sitio de oxidación indirectamente equilibrando 4PE con NAD + en presencia de PdxA y exceso de [4R-2 H] NADH o [4S - 2 H] NADH. La aparición de deuterio en 4PE debido a la transferencia de deuteruro al producto en la reacción inversa (ver Esquema 1) permitió la identificación del sitio de oxidación. Después de la incubación de 4PE con [4R-2 H] NADH y PdxA, la señal debida al protón C-3 de 4PE disminuye y las señales debidas a los protones C-2 y C-4 se alteran porque ya no se dividen. por un protón en C-3 (Figura 2E). Ninguna de las señales se altera en presencia de NADH (Figura 2D) o [4S-2 H] NADH (Figura 2F). Por tanto, la oxidación de 4PE se produce en C-3 en lugar de en C-2 y, por tanto, esta actividad de PdxA no puede sustituir la actividad de PdxB.

AroB también oxida 4PE, pero lleva a cabo una sola rotación (datos no mostrados). Esto no es sorprendente durante el ciclo catalítico normal de AroB, el NAD + fuertemente unido se reduce a NADH. Después de la eliminación del fosfato del intermedio oxidado, el NADH transfiere el hidruro de regreso al sustrato, regenerando el NAD + en el sitio activo (Carpenter et al, 1998). La oxidación de 4PE reduciría el NAD + fuertemente unido, pero no brindaría una oportunidad para la reoxidación e inactivaría la enzima. No podemos determinar la posición en la que AroB oxida 4PE utilizando el enfoque descrito anteriormente porque NADH no se libera de la enzima y no se puede reemplazar con NAD 2 H. Sin embargo, esta actividad probablemente no sea fisiológicamente relevante. Los experimentos genéticos que se describen a continuación sugieren esa complementación de la ΔpdxB tensión por sobreexpresión de aroB no se debe a su capacidad para oxidar el 4PE.

Estos resultados sugieren que la restauración del crecimiento en el ΔpdxB La cepa cuando se sobreproduce ThrB, YeaB, HisB, Php o PdxA (y probablemente AroB) no puede atribuirse al reemplazo de la actividad de PdxB. En consecuencia, exploramos la posibilidad de que la sobreproducción de estas enzimas facilite una o más vías fortuitas que permitan sintetizar PLP en ausencia de PdxB.

Los esfuerzos para complementar cepas que carecen de otros genes en la ruta de síntesis de PLP revelan tres vías fortuitas.

Se llevaron a cabo experimentos de supresión de múltiples copias utilizando cepas que carecen de otros genes en la vía de síntesis de PLP para identificar dónde las vías fortuitas facilitadas por las enzimas enumeradas en la Tabla I alimentan la vía de síntesis de PLP normal. En general, las cepas que carecen de enzimas aguas arriba del punto de intersección deberían crecer cuando está operando una vía fortuita, pero las cepas que carecen de enzimas aguas abajo del punto de intersección no deberían hacerlo. Estos experimentos fueron sencillos para la mayoría de las cepas, pero se complicaron por los requisitos de crecimiento de ΔserCkan cepa (en lo sucesivo denominada ΔserC cepa). Se requiere SerC para la síntesis tanto de PLP como de serina. Además, la eliminación de serC reduce la expresión de Aroa, que está codificado por el mismo operón (Duncan y Coggins, 1986). En consecuencia, el ΔserC La cepa requiere la adición de serina, piridoxina y productos de la vía del shikimato (Lam y Winkler, 1990) para crecer en un medio mínimo. Examinar la capacidad de las vías fortuitas para producir PLP en el ΔserC cepa, agregamos todos estos suplementos excepto piridoxina. Como control, examinamos el efecto de estos suplementos sobre la complementación del ΔpdxB cepa. Los suplementos no tienen ningún efecto sobre la complementación de ΔpdxB por pdxB, su b, yjbQ y php (Cuadro II). su b, php y yjbQ no complementan las cepas que carecen serC, pdxA, pdxJ o pdxH (Tabla II), lo que sugiere que la vía 2 forma 2-oxo-3-hidroxi-4-fosfobutanoato (OHPB) (Figura 1). Sin embargo, los suplementos inhiben la capacidad de thrB, síB, pdxA y aroB para complementar el ΔpdxB cepa. Se encontró que este efecto se debía únicamente a la presencia de serina (Tabla complementaria III). Una posible explicación es que las vías facilitadas por la sobreexpresión de estos genes comienzan con intermedios en la biosíntesis de serina que se agotan en presencia de serina debido a la inhibición alostérica de SerA, que cataliza el primer paso en la biosíntesis de serina (Grant et al, 1996). Sin embargo, la adición de serina tiene efectos pleiotrópicos (Hama et al, 1990, 1991 Beca et al, 1996), por lo que en este punto optamos por utilizar este fenotipo simplemente como una característica que distingue entre diferentes vías fortuitas.

Gene ΔpdxB (JU283) ΔpdxB (JU283) + supl. a a L-Ser (1,0 mM), L-Phe (0,1 mM), L-Tyr (0,1 mM), L-Trp (0,1 mM), pag-hidroxibenzoato (1 μM), pag-aminobenzoato (1 μM) y 2,3-dihidroxibenzoato (1 μM).
ΔserC (JWK0890) + supl. a a L-Ser (1,0 mM), L-Phe (0,1 mM), L-Tyr (0,1 mM), L-Trp (0,1 mM), pag-hidroxibenzoato (1 μM), pag-aminobenzoato (1 μM) y 2,3-dihidroxibenzoato (1 μM).
ΔpdxA (JWK0051) ΔpdxJ (JWK2548) ΔpdxH (JWK1630)
pdxB ++++ b b Las colonias alcanzaron 1 mm de diámetro en 1 a 2 días (++++), 3 a 5 días (+++) o 6 a 8 días (++). (+) indica colonias que fueron de 1 mm después de 9 días.
++++
su b ++++ ++++
yjbQ +++ +++
php ++++ ++++
thrB ++++ +
síB +++ +
pdxA +++ ++ ++++
aroB +++ + ++
  • Las designaciones de deformación se definen en la Tabla complementaria I.
  • a L-Ser (1,0 mM), L-Phe (0,1 mM), L-Tyr (0,1 mM), L-Trp (0,1 mM), pag-hidroxibenzoato (1 μM), pag-aminobenzoato (1 μM) y 2,3-dihidroxibenzoato (1 μM).
  • b Las colonias alcanzaron 1 mm de diámetro en 1 a 2 días (++++), 3 a 5 días (+++) o 6 a 8 días (++). (+) indica colonias que fueron de 1 mm después de 9 días.

síB y thrB complementar el ΔpdxB cepa, pero no complementan cepas que carecen de PdxA, PdxJ o PdxH. Estos datos sugieren que la vía 1 fortuita se alimenta en la vía normal al nivel de OHPB o 4-fosfohidroxitreonina (4PHT). La ambigüedad surge porque la serina requerida para el crecimiento de ΔserC La cepa interfiere con la complementación de la ΔpdxB colar por síB y thrB. Por lo tanto, no podemos determinar a partir de estos datos si la vía 1 se alimenta antes o después de la reacción catalizada por SerC. Sin embargo, los datos bioquímicos (ver más abajo) sugieren que la vía 1 genera 4PHT.

aroB complementa el ΔpdxA cepa, pero no complementa las cepas que carecen pdxJ o pdxH. Purificamos AroB de una cepa que carece de PdxA y determinamos que AroB no tiene actividad 4PHT deshidrogenasa detectable (datos no mostrados). Por tanto, la complementación del ΔpdxA tensión por sobreexpresión de aroB no se debe simplemente al reemplazo de la actividad de PdxA. Estos datos sugieren que la vía 3 forma 1-amino-propan-2-ona-3-fosfato.

Identificación de enzimas que pueden catalizar reacciones en la vía 1

Una posible secuencia de reacciones para la vía 1 es sugerida por las observaciones de que la adición de 3-hidroxipiruvato (3HP) (Shimizu y Dempsey, 1978), glicolaldehído (Tani y Dempsey, 1973) o 4HT (Drewke et al, 1993) pueden apoyar el crecimiento de ciertos E. coli mutantes que carecen de la capacidad de producir PLP. Los experimentos de marcaje isotópico confirmaron que los átomos de carbono del glicolaldehído (Hill y Spenser, 1973 Hill et al, 1977), glicina (Hill et al, 1987) y 4HT (Hill et al, 1996) y átomos de nitrógeno de la glicina (Hill et al, 1987) se incorporaron en piridoxol. Durante algún tiempo, estos compuestos se consideraron como probables intermediarios en la ruta de síntesis de PLP (Shimizu y Dempsey, 1978 Duncan y Coggins, 1986), aunque finalmente se resolvió la ruta que se muestra en la Figura 1. Confirmamos que nuestro ΔpdxB La cepa crece sobre M9 / glucosa a 37 ° C en presencia de 3HP, glicolaldehído y 4HT. Nuestra cepa también crece en presencia de 3PHP, un intermedio en la biosíntesis de serina (Tabla complementaria IV).

El primer paso de la vía propuesta 1 es la desfosforilación de 3PHP (Figura 3). E. coli contiene 75 fosfatasas conocidas o previstas que podrían catalizar esta reacción. Se sugirió una posibilidad intrigante por la observación de que la sobreproducción de YeaB, una hidrolasa NUDIX predicha, restaura el crecimiento de la ΔpdxB cepa. Las hidrolasas NUDIX típicamente catalizan la hidrólisis de pirofosfatos orgánicos (McLennan, 2006) y, por lo tanto, pueden tener una actividad fosfatasa de bajo nivel. Expresamos YeaB como una fusión con la proteína de unión a maltosa (MalE) para obtener proteína soluble. De hecho, la proteína de fusión MalE-YeaB tiene actividad fosfatasa 3PHP (Tabla III). Debido a que teníamos un suministro limitado de 3PHP, no pudimos determinar un KMETRO para 3PHP ya que la enzima parece estar saturada a 3PHP 2 mM, concluimos que el KMETRO para 3PHP debe ser & lt2 mM. La actividad de la fosfatasa 3PHP se debió a YeaB en lugar de MalE, ya que una proteína de fusión MalE-LacZ no mostró actividad. Observamos que la tasa no enzimática para la conversión de 3PHP en 3HP es 7.2 × 10 −10 M −1 s −1. Por lo tanto, aunque YeaB es una enzima ineficaz, eleva la tasa por encima de la tasa de fondo en un factor de 4 × 10 7.

Proteína Sustrato kgato (s −1) KMETRO (mM) kgato/KMETRO (M −1 s −1)
MalE – YeaB a a YeaB se expresó como una proteína de fusión con la proteína de unión a maltosa (MalE) para mejorar su solubilidad.
3PHP 5.7±0.7 × 10 −5 & lt2 & gt0.028 ± 0.003
Dxs Piruvato + D-GAP b b (Kuzuyama et al, 2000).
345 0,096 (piruvato) 3.6 × 10 6
0,24 (D-GAP) 1.4 × 10 6
3HP 0.026±0.001 0.050±0.008 5.2±0.4 × 10 2
SucA 3HP 0.0139±0.0003 0.72±0.07 19.3±1.9
LtaE L -allotreonina 3.2±0.2 0.052±0.004 6.2±0.5 × 10 4
L-treonina 1.1±0.1 4.0±0.2 2.8±0.2 × 10 2
4HT 1.44±0.03 0.027±0.002 5.3±0.4 × 10 4
ThrB Homoserina 46±4 0.12±0.02 3.8±0.7 × 10 5
4HT 9.7±0.8 2.0±0.1 4.8±0.6 × 10 3
  • Los sustratos involucrados en la vía 1 están resaltados en negrita.
  • a YeaB se expresó como una proteína de fusión con la proteína de unión a maltosa (MalE) para mejorar su solubilidad.
  • b (Kuzuyama et al, 2000).

Aunque YeaB es un catalizador ineficaz para la conversión de 3PHP en 3HP, el flujo a través de este paso debería ser suficiente para suministrar PLP. La concentración citoplasmática de MalB – YeaB es ∼45 μM (basada en la producción de 4,7 mg de proteína purificada a partir de 2,2 g de células húmedas). YeaB parece estar saturado a 1 mM de 3PHP, una suposición razonable para su concentración citoplásmica basada en la concentración de su precursor inmediato, 3-fosfoglicerato, que está presente a 1,5 mM en E. coli creciendo en glucosa (Bennett et al, 2009). Por lo tanto, el flujo será aproximadamente kgato [E] = (4,8 × 10 −5 s −1) (45 µM) = 7,8 µM h −1 (Bennett et al, 2009). En la información complementaria, describimos un cálculo que sugiere que el ΔpdxB La cepa sintetiza PLP a una velocidad de ~ 5,5 µM h -1 cuando MalB-YeaB se sobreexpresa. Por tanto, la tasa de conversión de 3PHP en 3HP por YeaB es comparable a la tasa de síntesis de PLP.

We note that there is precedence for the ability of such an inefficient enzyme to supply sufficient flux to replace a critical metabolic enzyme. Patrick and Matsumura (2008) have shown that overexpression of a promiscuous enzyme (I198V glutamine 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate amidotransferase (PurF)) substitutes for a lack of phosphoribosylanthranilate isomerase (TrpF), which is required for tryptophan synthesis. los kgato/KMETRO for the promiscuous TrpF activity of I198V PurF is estimated to be 0.012 M −1 s −1 ( Patrick and Matsumura, 2008 ) the kgato/KMETRO for the 3PHP phosphatase activity of YeaB (>0.024 M −1 s −1 ) is greater than this.

If YeaB is the only enzyme that converts 3PHP to 3HP, a ΔpdxB ΔyeaB strain should not grow on minimal medium supplemented with 3PHP. However, this strain does grow slowly, producing colonies <1 mm in diameter after 9 days, on M9/glucose (Supplementary Table IV). These results suggest that at least one other enzyme can generate 3HP when 3PHP is present at high levels. As the ΔpdxB strain grows after 4 days when YeaB is overproduced, we conclude that overproduction of YeaB is the most efficient way to siphon material from the serine biosynthesis pathway into pathway 1, but YeaB is not the only enzyme that can produce 3HP from 3PHP.

3HP is proposed to be converted to glycolaldehyde in pathway 1. This conversion might occur by either of two routes. Direct decarboxylation of α-keto acids is catalyzed by enzymes that contain thiamine pyrophosphate (TPP). Alternatively, glycolaldehyde might be formed by initial isomerization of 3HP to the β-keto acid tartronate semialdehyde, followed by decarboxylation of tartronate semialdehyde. To search for enzymes in E. coli that catalyze decarboxylation of 3HP by either route, we attempted to measure acceleration of glycolaldehyde production from 3HP by crude extracts of E. coli K-12 BW25113 in the presence of NADH and alcohol dehydrogenase, which converts glycolaldehyde to ethylene glycol ( Barngrover et al, 1981 ). We were unable to detect any acceleration of the conversion of 3HP to glycolaldehyde. As we could not rule out inefficient catalysis that fails to rise significantly above the background rate, we examined the catalytic abilities of specific candidate enzymes that might convert 3HP to glycolaldehyde.

E. coli has 12 enzymes that are known or predicted to utilize TPP. We purified 10 of these: 1-deoxyxylulose-5-phosphate synthase (Dxs), pyruvate oxidase, transketolase A, transketolase B, glyoxalate carboligase and the predicted oxalyl CoA decarboxylase, as well as the TPP-dependent catalytic components of the multisubunit enzymes pyruvate dehydrogenase, α-ketoglutarate dehydrogenase and both isozymes of acetohydroxy acid synthase. YdbK and 2-succinyl-6-hydroxy-2,4-cyclohexadiene-1-carboxylate synthase (MenD) could not be expressed in soluble form. Only Dxs and SucA, the TPP-dependent catalytic component of the α-ketoglutarate dehydrogenase complex, had detectable 3HP decarboxylase activity (Table III).

To determine whether Dxs, SucA, YdbK or MenD is required for operation of pathway 1, we constructed double-knockout strains lacking pdxB and each of the genes encoding these enzymes. We also constructed a ΔpdxB Δdxs ΔsucA strain to determine whether glycolaldehyde formation is due to a combination of the activities of Dxs and SucA. Each of these strains grew on M9/glucose when YeaB or ThrB was overproduced at 37°C (data not shown). These results suggest that TPP-containing enzymes are not responsible for the formation of glycolaldehyde in pathway 1.

los E. coli genome encodes a hydroxypyruvate isomerase (Hyi) that converts 3HP to tartronate semialdehyde. This enzyme is expressed only when cells are grown on glyoxylate ( Ashiuchi and Misono, 1999 ). We ruled out the possibility that Hyi has a role in pathway 1 by constructing a ΔpdxB Δhyi cepa. This strain grows on glucose when either yeaB o thrB is overexpressed or when 3HP is supplied in the medium (data not shown).

We next considered the possibility that conversion of 3HP to glycolaldehyde in pathway 1 might be non-enzymatic. We measured the rate of formation of glycolaldehyde from 3HP by 1 H-NMR. 3HP is converted to glycolaldehyde, glycolic acid and erythrulose (by reaction with glycolaldehyde, followed by decarboxylation) (Figure 4). A control experiment showed that glycolaldehyde decomposed under these conditions to unidentified products with a first-order rate constant of 0.0062±0.0003 h −1 . The kinetic model shown below was used for numerical simulation of the rate constants for appearance of glycolaldehyde (k1=0.0153±0.0003 h −1 ), erythrulose (k2=0.0092±0.0005 mM −1 h −1 ) and glycolic acid (k3=0.0069±0.0003 h −1 ), assuming that k4=0.0062 h −1 , using DynaFit ( Kuzmič, 1996 ). Notably, addition of 0.1 mM TPP had no effect on the rate of formation of glycolaldehyde. Thus, glycolaldehyde formation must occur through the initial formation of tartronate semialdehyde. Decarboxylation of β-keto acids such as tartronate semialdehyde can be accelerated by metal ions ( Hedrick and Sallach, 1961 ). However, addition of Mg ++ or Ca ++ (1 mM) had no effect on the rate of glycolaldehyde formation. Addition of Cu ++ , Co ++ , Ni ++ , Zn ++ or Mn ++ (1 mM) actually decreased the rate of glycolaldehyde formation, while concomitantly increasing the rate of glycolate formation.

The observed rate of conversion of 3HP to glycolaldehyde appears to be sufficient to supply a significant portion of the glycolaldehyde needed for the production of PLP. We estimate that the ΔpdxB strain synthesizes PLP at a rate of 5.5 μM h −1 when yeaB is overexpressed (Supplementary information). We estimated above that the rate of production of 3HP from 3PHP should be ∼8 μM h −1 . At steady state, the rates of production and depletion of 3HP are balanced. As formation of erythrulose is negligible unless the glycolaldehyde concentration exceeds 1 mM, which is unlikely, we can calculate the steady state concentration of 3HP by assuming that the rates of formation and disappearance of 3HP are equal at the steady state. Using the relationship 8 μM h −1 =(k1+k3) [3HP]ss, we calculate that [3HP]ss is ∼360 μM. If the concentration of 3HP is 360 μM, the rate of formation of glycolaldehyde will be 5.5 μM h −1 . Glycolaldehyde will also be formed during conversion of 7,8-dihydro- D -neopterin to 6-hydroxymethyl-7,8-dihydropterin by FolB in the folate biosynthesis pathway. If folate is synthesized at a rate comparable with that of PLP, this reaction could supply glycolaldehyde at ∼5 μM h −1 . Although the amount of glycolaldehyde produced by FolB is clearly not sufficient to supply pathway 1 in the ΔpdxB strain, the combined generation of glycolaldehyde from 3HP and 7,8-dihydro- D -neopterin may well be sufficient when yeaB is overexpressed, even if some glycolaldehyde is lost by diffusion through the membrane.

The next step in pathway 1 is formation of 4HT, which is not a recognized metabolite in E. coli. 4HT can be formed by aldol condensation of glycine and glycolaldehyde ( Dempsey, 1987 ). los E. coli genome encodes an enzyme annotated as low-specificity threonine aldolase (LtaE). The physiological function of this enzyme is unknown it cleaves L -allo-threonine most efficiently among known substrates ( Liu et al, 1998 ), but L -allo-threonine is also not a recognized metabolite in E. coli. We assayed the rate of cleavage of L -allo-threonine, L -threonine and 4HT by LtaE (Table III). (The aldolase reaction is the reverse of the aldol condensation proposed in the latent pathway, but aldol condensation reactions are generally reversible.) Notably, cleavage of 4HT is nearly as efficient as cleavage of L -allo-threonine. We examined the products formed by the LtaE-catalyzed aldol condensation of glycolaldehyde and glycine by NMR (Supplementary Figure 2). The reaction forms 4HT and 4-hydroxy- L -allo-threonine (4-allo-HT) in a ratio of 1.0:0.7. (LtaE does not cleave the D -isomers of threonine and allo-threonine ( Liu et al, 1998 ), so we do not expect formation of 4-hydroxy- D -threonine and 4-hydroxy- D -allo-threonine.) These data show that LtaE catalyzes the aldol condensation of glycine and glycolaldehyde, but the stereochemistry of the reaction is not well controlled, and a substantial amount of the allo-isomer is produced. However, this does not necessarily divert material from pathway 1. As the aldol condensation is reversible and the equilibrium favors the substrates, material sequestered in 4-allo-HT will ultimately be drawn into the pathway as 4HT is converted to downstream products, as long as 4-allo-HT is not converted to any other products. The most obvious enzyme that might utilize 4-allo-HT is ThrB, which phosphorylates 4HT. However, ThrB does not phosphorylate 4-allo-HT (Supplementary Figure 3).

We confirmed that LtaE is responsible for the formation of 4HT by pathway 1 en vivo by constructing a ΔpdxB ΔltaE cepa. This strain can grow on M9/glucose in the presence of pyridoxine, but does not grow when intermediates upstream of the proposed aldol condensation (3PHP, 3HP or glycolaldehyde) are supplied (Supplementary Table IV). It can, however, grow when 4HT is supplied. Furthermore, overproduction of YeaB does not complement the ΔpdxB ΔltaE strain (data not shown), confirming that LtaE and YeaB participate in the same pathway.

The last step in the proposed pathway 1 is phosphorylation of 4HT. We suspected that homoserine kinase (ThrB) might catalyze this reaction since it phosphorylates homoserine, which is structurally similar to 4HT. Furthermore, ThrB was previously shown to be required for the growth of a ΔpdxB strain on glucose at 37°C in the presence of glycolaldehyde or 4HT ( Zhao and Winkler, 1996a ). ThrB does indeed turn over 4HT, but with an efficiency nearly two orders of magnitude lower than that for homoserine (Table III). We confirmed that ThrB is responsible for phosphorylation of 4HT en vivo by constructing a ΔpdxB ΔthrB cepa. This strain can grow on glucose in the presence of pyridoxine, but not when intermediates upstream of the proposed phosphorylation reaction are supplied (Supplementary Table IV).

Confirmation that pathway 1 diverts material from serine biosynthesis

We carried out two experiments to test the proposition that YeaB diverts 3PHP from serine biosynthesis into serendipitous pathway 1 en vivo. First, we generated a ΔpdxB ΔserA strain that cannot make 3PHP. Pathway 1 should not operate in this strain even if yeaB is overexpressed. As predicted, the ΔpdxB ΔserA strain cannot grow on M9/glucose supplemented with serine when yeaB is overexpressed, although it can grow when pdxB is overexpressed (see Table IV). Because addition of serine can cause inhibition of ThrA ( Hama et al, 1990 , 1991 ) and thus impair synthesis of threonine and methionine, we also assessed the growth of the ΔpdxB ΔserA strain on M9/glucose supplemented with both serine and homoserine. Under these conditions as well, the ΔpdxB ΔserA strain cannot grow when yeaB is overexpressed. These results are consistent with the hypothesis that the lack of growth is due to a lack of 3PHP, but do not rule out an additional unanticipated inhibitory effect of serine on pathway 1. To address this possibility, we constructed a ΔpdxB strain carrying an allele of serA that encodes a serine-insensitive enzyme (designated serA′) ( Grant et al, 2005). As SerA′ is insensitive to feedback inhibition by serine, addition of serine does not shut off flux through the serine biosynthesis pathway. Thus, we predict that this strain should grow on M9/glucose supplemented with serine and homoserine when yeaB is overexpressed if there is no other inhibitory effect of serine. Indeed, complementation of the ΔpdxB serA′ strain by yeaB is unaffected by the addition of serine and homoserine (Table IV). Together with the demonstration that YeaB catalyzes conversion of 3PHP to 3HP in vitro, these results provide strong support for the proposition that serendipitous pathway 1 diverts 3PHP from the serine biosynthesis pathway.

Supplements a a L-serine concentration was 1mM and L-homoserine concentration was 50 μM.
Strain and overexpressed gene
ΔpdxB (JU283) ΔpdxB ΔserA (JU425) ΔpdxB serA’ (JU430)
pdxB yeaB pdxB yeaB pdxB yeaB
Ninguno ++++ b b Colonies reached 1mm diameter in 1–2 days (++++), 3–5 days (+++) or 6–8 days (++). (+) indicates colonies that were o1mm after 9 days.
+++ ++++ ++
L -serine ++++ + +++ +++
L -serine+ L -homoserine ++++ + +++ ++++ ++
  • Strain designations are defined in Supplementary Table 1.
  • a L-serine concentration was 1mM and L-homoserine concentration was 50 μM.
  • b Colonies reached 1mm diameter in 1–2 days (++++), 3–5 days (+++) or 6–8 days (++). (+) indicates colonies that were o1mm after 9 days.

Complementation by PdxA depends on pathway 1

Our observation that overproduction of PdxA complements the ΔpdxB strain is curious. As described above, PdxA oxidizes 4PE at C-3 and therefore cannot substitute for PdxB. Sobreexpresión de pdxA does not restore growth of the ΔpdxB ΔltaE strain on M9/glucose (data not shown), suggesting that complementation by pdxA depends on the presence of LtaE and therefore on pathway 1. We suspect that overproduction of PdxA increases the rate of consumption of 4PHT formed by the inefficient serendipitous pathway, effectively pulling material through the pathway by catalyzing the thermodynamically favorable conversion of 4PHT to 1-amino-propan-2-one-3-phosphate.

Pathway 1 can be elevated to physiological significance at 37°C by spontaneous mutations

Pathway 1 appears to operate even without the overproduction of YeaB or ThrB during growth on minimal medium at 30°C. Previous workers reported that a ΔpdxB strain grows slowly on glucose with mucoid morphology at 30°C, but not at 37°C ( Lam and Winkler, 1990 ). Our ΔpdxB strain, which differs somewhat from the strain used by Lam and Winkler (1990 ), also shows slow growth on M9/glucose at 30°C. As neither the ΔpdxB ΔltaE strain nor the ΔpdxB ΔthrB strain grows at 30°C (data not shown), pathway 1 can apparently generate sufficient PLP for slow growth at 30°C in the absence of PdxB.

Pseudorevertants of the ΔpdxB strain that grow on M9/glucose at 37°C arise frequently. We have deleted ltaE in one of these pseudorevertants (JK19). Deletion of ltaE slows growth at 37°C substantially small mucoid colonies can be seen after incubation for 5 days, whereas colonies of the pseudorevertant JK19 are much larger (Figure 5). (The variation in colony size seen in Figure 5A was observed repeatedly, even when plates were streaked from a single colony, suggesting that colony phenotype is influenced by some type of phase variation.) These results suggest that pathway 1 contributes significantly to PLP synthesis in pseudorevertant JK19, although is apparently not the only source of PLP. Efforts to identify the mutations responsible for the newly acquired ability of this pseudorevertant to grow at 37°C on M9/glucose are in progress.


Johndoeanonymous

Ampicillin Resistance in E. coli During DNA Transformation

The lab “DNA Transformation-Ampicillin Resistance” tested four different variables (“B1 Amp,” “B1 No Amp,” “B2 Amp,” and “B2 No Amp) , to show how a plasmid with a resistance gene to the antibiotic ampicillin can be used to place the resistance gene into an able strand of bacteria. Both microcentrifuge tubes (labeled “B1” and “B2”) contained the E. coli bacteria and calcium chloride solution. Microcentrifuge tube “B1” received a drop of a solution, which has a gene that is resistant to ampicillin. In the results, “B2 Amp” had no bacterial growth, “B1 Amp” had growth in the form of multiple small colonies, and “B2 No Amp” and “B1 No Amp” both had regular bacterial growth. These results explain how DNA transformation works, and how it can be used in medical science.

Ampicillin: A semisynthetic penicillin used to treat various infections.

Cell Suspension: Cells in culture in moving or shaking liquid medium, often used to describe suspension cultures of single cells and cell aggregates.

E. coli: A bacillus Escherichia coli a bacillus normally found in the human gastrointestinal tract and existing as numerous strains, some of which are responsible for diarrheal diseases. Other strains have been used experimentally in molecular biology.

Resistant: impervious to the action of corrosive substances.

Nonresistant: Not resistant, especially to a disease or an environmental factor, such as heat or moisture.

Transformation: genetic modification of a bacterium by incorporation of free DNA from another ruptured bacterial cell compare.

Agar: A moist support medium used to grow bacteria.

DNA transformation refers to “the uptake and expression of foreign DNA in a living cell. Originally defined as an inherited alteration of the phenotype of the transformed cell, see stable and transient”. This meaning taking DNA from one cell, and introducing it into another cell, that may give different phenotypic (physical) outcomes. In this lab, a plasmid DNA was given to the microcentrifuge tube “B1” which gave it a gene that is resistant to ampicillin. This means that the results should show “B1” having some sort of bacterial growth on the petri dishes. It is apparent that the transformation occurred if the plate labeled “B1 Amp” had growth in the form of colonies, which means that some of the bacterial DNA took up the plasmid DNA that was resistant to ampicillin, therefor making some of the bacteria resistant as well. The bacteria on the “B1” plate will show DNA transformation because the plasmid DNA will give the bacteria DNA a gene for resistance to the ampicillin.

To complete this experiment, the following supplies will be needed: four petri dishes containing agar, two microcentrifuge tubes labeled B1 and B2, four sterile toothpicks, four sterile paperclips, ice, two pipettes, and access to an incubator (needed to heat the petri dishes to 37°C for 24 hours).

Step 1: Use a sterile toothpick to add a very small (about the size of this 0) colony of E. coli into two microcentrifuge tubes (the ones labeled B1 and B2) along with two drops of calcium chloride (which helps the bacterial DNA accept the plasmid DNA). Gently mix the E. coli with the calcium chloride solution until it appears milky. Firmly close both microcentrifuge tubes and safely dispose of the toothpicks that were used into a container to be destroyed(not the trash).

Step 2: Place the microcentrifuge tubes into a tub of ice and wait approximately fifteen minutes. (Do not freeze the tubes, the chilled calcium chloride within the tubes are the correct conditions for DNA uptake.)

Step 1: Gently finger flick the microcentrifuge tubes to suspend the cells.

Step 2: Open the tube labeled “B1” and use the sterile pipette to place one drop of solution from the “P” tube into the “B1” tube. DO NOT add anything to the “B2” tube. (The plasmid DNA from the “P” tube that was added to “B1” has a gene resistance to the antibiotic ampicillin.)

Step 3: Place both tubes in ice again for fifteen minutes. (The cells are kept cold to prevent them from growing within the tubes while the plasmids are being absorbed.)

Step 4: Take both tubes out of the ice and put them into a 42°C water bath immediately for 90 seconds. (The temperature change causes the cells to readily absorb the plasmid DNA, that was placed into tube B1.)

Step 5: Use a sterile pipette to put five drops of a sterile nutrient broth into both tube “B1” and “B2”. Close the tubes tightly, and mix the solutions by tipping them gently. (The bacteria are now provided nutrients to help them recover from the calcium chloride and heatshock treatments.)

Step 6: Label the bottom of the four petri dishes with “B1 No Amp,” “B2 No Amp,” “B1 Amp,” and “B2 Amp.” Also, be sure to properly identify the person who is doing the experiment.

Step 7: Using another sterile pipette, place three drops of cell suspension from the tube labeled “B1” onto the two petri dishes labeled “B1”. Then use a sterile paperclip to gently and evenly spread the suspension across the agar, be sure not to touch the part of the paperclip that comes into contact with the agar, so as not to compromise the containment of the E. coli. Do the same thing for the cell suspension in tube “B2,” onto the petri dishes labeled “B2”.

Step 8: Incubate the four petri dishes upside down for at least 24 hours at 37°C.

Step 9: Look over the results of the transformation on each of the four petri dishes.

The results of the lab are as follows:

B2 Amp B1 Amp B1 No Amp B2 No Amp

“B2 Amp” (Amp standing for ampicillin) shows no bacterial growth. This is because the bacteria are killed because they had no resistance to the antibiotic ampicillin. The ampicillin that was introduced to the bacteria killed every cell leaving none to reproduce and grow on the petri dish. The plate labeled “B1 Amp” showed some bacterial growth in the form of many little clusters, called colonies. The growth that is shown is from the bacteria that took up plasmids (that were added in step 2), and then became resistant to ampicillin. Since not all of the bacterium were resistant, only some grew, showing the colonies you see in the above photo labeled “B1 Amp”. On both plates “B1 No Amp” and “B2 No Amp” the bacteria grew normally. The antibiotic was not present therefore both the resistant and nonresistant bacteria grew normally.

The result of the experiment did prove that the hypothesis was correct. The procedure went as expected, and no unexpected results were encountered. The data that was collected from the results explain how DNA transformation works and supports the hypothesis. Some of variables that were in the experiment could have produced different results, are incorrect temperatures, inaccurate mixing methods, contamination of the petri dishes or the tools (such as the toothpicks, paperclips, or pipettes), or a breach of containment of the E. coli bacterias. The results directly support DNA transformation in that the plate labeled “B1 Amp” grew in colonies, stating that some of the bacterial DNA had the resistance gene and some did not, supporting the hypothesis in that DNA transformation gave the bacteria the ability to grow because of the gene in the plasmid DNA. The experiment went successfully and proves the hypothesis to be correct.

In this lab, DNA transformation was proved. The results depict a transformation occurring with the bacteria DNA and the plasma DNA where the bacteria DNA receives a gene from the plasmid DNA that is resistant to ampicillin. The plate “B1 Amp” shows growth in colonies where some of the bacteria was resistant and some was not. The bacteria that was not resistant, simply did not receive the resistant gene through transformation.

I would like to thank the Iowa State University for the clearly outlined lab instructions and equipment. I would also like to recognize my father, Alex Hefflefinger, for reading over this lab report and helping me along the way.


E. coli Strain ALS1059

From the laboratory of Mark A. Eiteman, PhD, University of Georgia.

Tipo de producto: Bacterias Nombre: ALS1059 Cell Type: Bacterias Organism: Escherichia coli Strain: ALS1059 Genotype: Hfr zbi::Tn10 poxB1 &Delta(aceEF) rpsLpps-4 pfl-1 ldhA::Kan arcA726::(FRT) atpFH::Cam Antibiotic Resistance: Kanamycin, chloramphenicol Growth Conditions: TYA medium, 10g/L tryptone, 5g/L NaCl, 1g/L yeast extract, 1.36 g/L sodium acetate trihydrate Na(CH3COO)?3H2O, pH adjusted to 7.0, aerobic 37C Formato: Lyophilized culture Storage: Room temperature as lyophilized culture Shipped: Temperatura ambiente

Protocol Notes

  1. Inject 1 mL of sterile DI water into vial and gently mix.
  2. Use small portions of vial (liquid) contents to inoculate a sterile, liquid culture to an initial OD of 0.03-0.1. For this liquid culture, use the specified growth medium with or without an antibiotic as appropriate.
  3. When culture has visibly grown in liquid medium, plate on solid (Agar) growth medium and incubate at 37C. Maintain strain.
Cepa Fenotipo
ALS974 Accumulates lactic acid
ALS929 Accumulates pyruvic acid
ALS1392 Does not metabolize arabinose, glucose nor xylose
ALS1391 Does not metabolize arabinose nor xylose
ALS1371 Does not metabolize arabinose nor glucose
ALS1370 Does not metabolize xylose nor glucose
ALS1074 Does not metabolize xylose but can accumulate lactic acid from glucose
ALS1073 Does metabolize glucose but can accumulate lactic acid from xylose
ALS1060 Does not metabolize xylose nor glucose
ALS1059 Accumulates pyruvic acid
ALS1058 Does not metabolize glucose
ALS1048 Does not metabolize glucose
ALS1038 Does not metabolize xylose
ALS1054 Accumulates pyruvic acid
ALS1122 Does not metabolize xylose nor glucose
  1. Y. Zhu, M. A. Eiteman, R. Altman, E. Altman, “High glycolytic flux improves pyruvate production by a metabolically engineered Escherichia coli strain,” Applied and Environmental Microbiology, 74(21):6649-6655 (2008) doi: 10.1128/AEM.01610-08
  2. A. Tomar, M. A. Eiteman, E. Altman, “The effect of acetate pathway mutations on the production of pyruvate in Escherichia coli,” Applied Microbiology and Biotechnology, 62, 76-82 (2003) doi: 10.1007/s00253-003-1234-6
  3. G. N. Vemuri, M. A. Eiteman, E. Altman, "Succinate production in dual-phase Escherichia coli fermentations depends on the time of transition from aerobic to anaerobic conditions," Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 28(6), 325-332 (2002) doi:10.1038/sj.jim.7000250
  4. Y. Zhu, M. A. Eiteman, S. A. Lee, E. Altman, “Conversion of glycerol to pyruvate by Escherichia coli using acetate- and acetate/glucose-limited fed-batch processes,” Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 37:307-312 (2010) doi: 10.10007/s10295-009-0675-z
  5. Y. Zhu, M. A. Eiteman, E. Altman, “Indirect monitoring of acetate exhaustion and cell recycle improve lactate production by non-growing Escherichia coli,” Biotechnology Letters, 30:1943-1946 (2008) doi: 10.1007/s10529-008-9775-5
  6. US Patent Numbers 7,749,740, 8,278,076 and 8,652,825.

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