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B4. Glicoproteínas ligadas a O - Biología


Los CHO generalmente se unen desde una Gal (b 1-3) GalNAc a una Ser o Thr de una proteína.

Figura: Glicoproteínas ligadas a O

Los antígenos del grupo sanguíneo (CHO en células unidas a proteínas o lípidos) son ejemplos. Los azúcares que se muestran como sillas en la figura siguiente son los antígenos de los grupos sanguíneos (en contraste con las estructuras que se encuentran en muchos textos). Están unidos a un heterosacárido central (que se muestra como elipse rojo a continuación) que está conectado a una glicoproteína de membrana o un glicolípido.

Figura: Antígenos de grupos sanguíneos


Qué son las glicoproteínas y para qué sirven

Una glicoproteína es un tipo de molécula de proteína a la que se le ha unido un carbohidrato. El proceso ocurre durante la traducción de proteínas o como una modificación postraduccional en un proceso llamado glicosilación.

El carbohidrato es una cadena de oligosacáridos (glicano) que está unida covalentemente a las cadenas laterales polipeptídicas de la proteína. Debido a los grupos -OH de los azúcares, las glicoproteínas son más hidrófilas que las proteínas simples. Esto significa que las glicoproteínas se sienten más atraídas por el agua que las proteínas comunes. La naturaleza hidrófila de la molécula también conduce al plegamiento característico de la estructura terciaria de la proteína.

El carbohidrato es una molécula corta, a menudo ramificada, y puede consistir en:

  • azúcares simples (por ejemplo, glucosa, galactosa, manosa, xilosa)
  • amino azúcares (azúcares que tienen un grupo amino, como N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina)
  • azúcares ácidos (azúcares que tienen un grupo carboxilo, como el ácido siálico o el ácido N-acetilneuramínico)

La glicosilación de tipo mucina ligada a O regula el programa transcripcional aguas abajo de EGFR

La glicosilación unida a O de tipo mucina aberrante es una ocurrencia común en el cáncer donde la regulación positiva de las sialiltransferasas a menudo se ve que conduce a la terminación temprana de las cadenas de O-glicano. La glicosilación ligada a O de tipo mucina no se limita a las mucinas y se produce en muchas glicoproteínas de la superficie celular, incluido el EGFR, donde el número de sitios puede ser limitado. Tras la ligadura de EGF, EGFR induce una cascada de señalización y también puede translocarse al núcleo donde regula directamente la transcripción de genes, un proceso modulado por Galectin-3 y MUC1 en algunos cánceres. Aquí, mostramos que tras la unión de EGF, las células de cáncer de mama que llevan diferentes O-glicanos responden transcribiendo diferentes firmas de expresión génica. MMP10, el gen principal regulado al alza cuando las células que portan glucanos del núcleo 1 sialilados se estimularon con EGF, también se regula al alza en el carcinoma de mama ER-positivo que expresa niveles elevados de ST3Gal1 y, por tanto, principalmente O-glucanos sialilados del núcleo 1. Por el contrario, las células isogénicas diseñadas para transportar glucanos del núcleo 2 regulan positivamente CX3CL1 y FGFBP1 y estos genes están regulados positivamente en los carcinomas de mama ER negativos, también conocidos por expresar 2 O-glucanos de núcleo más largos. Los cambios en la O-glicosilación no alteraron significativamente la transducción de señales aguas abajo de EGFR en las células que expresan O-glicano del núcleo 1 o del núcleo 2. Sin embargo, se observaron cambios notables en la formación de un complejo EGFR / galectina-3 / MUC1 / β-catenina en la superficie celular que está presente en las células que portan O-glicanos basados ​​en núcleo corto 1 pero ausente en las células portadoras del núcleo 2.

Palabras clave: Transcripción de glicosilación O-ligada a EGFR Galectina-3 MUC1.


Contenido

O-norte-acetilgalactosamina (O-GalNAc) Editar

Además de norte-acetilgalactosamina (GalNAc) a una serina o treonina ocurre en el aparato de Golgi, después de que la proteína se ha plegado. [1] [6] El proceso se realiza mediante enzimas conocidas como transferasas GalNAc (GALNT), de las cuales hay 20 tipos diferentes. [6] La inicial O-La estructura de GalNAc puede modificarse mediante la adición de otros azúcares u otros compuestos como grupos metilo y acetilo. [1] Estas modificaciones producen 8 estructuras centrales conocidas hasta la fecha. [2] Diferentes células tienen diferentes enzimas que pueden agregar más azúcares, conocidas como glicosiltransferasas, y las estructuras, por lo tanto, cambian de una célula a otra. [6] Los azúcares habituales añadidos incluyen galactosa, norte-acetilglucosamina, fucosa y ácido siálico. Estos azúcares también pueden modificarse mediante la adición de sulfatos o grupos acetilo.

Biosíntesis Editar

La GalNAc se añade a un residuo de serina o treonina de una molécula precursora, mediante la actividad de una enzima transferasa de GalNAc. [1] Este precursor es necesario para que el azúcar se pueda transportar a donde se agregará a la proteína. El residuo específico al que se unirá GalNAc no está definido, ya que existen numerosas enzimas que pueden añadir el azúcar y cada una favorecerá distintos residuos. [7] Sin embargo, a menudo hay residuos de prolina (Pro) cerca de la treonina o la serina. [6]

Una vez que se ha agregado este azúcar inicial, otras glicosiltransferasas pueden catalizar la adición de azúcares adicionales. Dos de las estructuras más comunes que se forman son el Núcleo 1 y el Núcleo 2. El Núcleo 1 se forma mediante la adición de un azúcar de galactosa a la GalNAc inicial. Core 2 consta de una estructura Core 1 con una estructura adicional norte-Azúcar acetilglucosamina (GlcNAc). [6] Un polinorte-La estructura de acetil-lactosamina puede formarse mediante la adición alterna de azúcares GlcNAc y galactosa sobre el azúcar GalNAc. [6]

Los azúcares terminales en los O-glicanos son importantes en el reconocimiento de las lectinas y juegan un papel clave en el sistema inmunológico. La adición de azúcares fucosa por las fucosiltransferasas forma los epítopos de Lewis y el andamio para los determinantes del grupo sanguíneo. La adición de una fucosa sola crea el antígeno H, presente en personas con el grupo sanguíneo O. [6] Al agregar una galactosa a esta estructura, se crea el antígeno B del grupo sanguíneo B. Alternativamente, agregar un azúcar GalNAc creará el antígeno A para el grupo sanguíneo A.

Funciones Editar

O-Los azúcares GalNAc son importantes en una variedad de procesos, incluida la circulación de leucocitos durante una respuesta inmune, la fertilización y la protección contra microbios invasores. [1] [2]

O-Los azúcares galNAc son comunes en las glicoproteínas de membrana, donde ayudan a aumentar la rigidez de la región cercana a la membrana para que la proteína se extienda más allá de la superficie. [6] Por ejemplo, el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDL) se proyecta desde la superficie celular por una región rigidizada por O-glicanos. [2]

Para que los leucocitos del sistema inmunológico se muevan hacia las células infectadas, deben interactuar con estas células a través de receptores. Los leucocitos expresan ligandos en su superficie celular para permitir que ocurra esta interacción. [1] El ligando 1 de glicoproteína de P-selectina (PSGL-1) es un ligando de este tipo y contiene muchos O-glicanos que son necesarios para su función. Los O-glicanos cerca de la membrana mantienen la estructura alargada y es necesario un epítopo sLe x terminal para las interacciones con el receptor. [8]

Las mucinas son un grupo de proteínas fuertemente O-glicosiladas que recubren los tractos gastrointestinal y respiratorio para proteger estas regiones de la infección. [6] Las mucinas tienen carga negativa, lo que les permite interactuar con el agua y evitar que se evapore. Esto es importante en su función protectora, ya que lubrica los tractos para que las bacterias no se unan e infecten el cuerpo. Los cambios en las mucinas son importantes en numerosas enfermedades, como el cáncer y la enfermedad inflamatoria intestinal. La ausencia de O-glicanos en las proteínas de mucina cambia su forma tridimensional de manera espectacular y, a menudo, impide su correcto funcionamiento. [1] [9]

O-norte-acetilglucosamina (O-GlcNAc) Editar

Además de norte-acetilglucosamina (O-GlcNAc) a residuos de serina y treonina generalmente ocurre en proteínas citoplasmáticas y nucleares que permanecen en la célula, mientras que O-Las modificaciones de la GalNAc suelen producirse en las proteínas que se secretarán. [10] La modificación se descubrió recientemente, pero la cantidad de proteínas que la contienen está aumentando rápidamente. [7] Es el primer ejemplo de glicosilación que no ocurre en proteínas secretoras.

O-GlcNAcilación se diferencia de otros procesos de O-glicosilación porque generalmente no se agregan azúcares a la estructura del núcleo y porque el azúcar se puede unir o eliminar de una proteína varias veces. [6] [7] Esta adición y eliminación ocurre en ciclos y es realizada por dos enzimas muy específicas. La O-GlcNAc se agrega mediante O-GlcNAc transferasa (OGT) y se elimina mediante O-GlcNAcase (OGA). Debido a que solo hay dos enzimas que afectan esta modificación específica, están reguladas de manera muy estricta y dependen de muchos otros factores. [11]

Debido a que se puede agregar y eliminar O-GlcNAc, se conoce como una modificación dinámica y tiene muchas similitudes con la fosforilación. La O-GlcNAcilación y fosforilación pueden ocurrir en los mismos residuos de treonina y serina, lo que sugiere una relación compleja entre estas modificaciones que puede afectar muchas funciones de la célula. [6] [12] La modificación afecta procesos como la respuesta de las células al estrés celular, el ciclo celular, la estabilidad de las proteínas y el recambio de proteínas. Puede estar implicado en enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson y el Alzheimer de aparición tardía [1] [12] y se ha descubierto que desempeña un papel en la diabetes. [13]

Además, la O-GlcNAcilación puede potenciar el Efecto Warburg, que se define como el cambio que se produce en el metabolismo de las células cancerosas para favorecer su crecimiento. [6] [14] Debido a que tanto la O-GlcNAcilación como la fosforilación pueden afectar residuos específicos y, por lo tanto, ambas tienen funciones importantes en la regulación de las vías de señalización, ambos procesos proporcionan objetivos interesantes para la investigación del cáncer.

O-Manosa (O-Hombre) Editar

La O-manosilación implica la transferencia de una manosa de un dolicol-PAG-molécula donante de manosa sobre el residuo de serina o treonina de una proteína. [15] La mayoría de los otros procesos de O-glicosilación utilizan un nucleótido de azúcar como molécula donante. [7] Otra diferencia con otras O-glicosilaciones es que el proceso se inicia en el retículo endoplásmico de la célula, en lugar del aparato de Golgi. [1] Sin embargo, se produce una mayor adición de azúcares en el Golgi. [15]

Hasta hace poco, se creía que el proceso se limitaba a los hongos, sin embargo, ocurre en todos los dominios de la vida eucariotas, (eu) bacterias y archae (bacteri) a. [16] La proteína humana O-manosilada mejor caracterizada es el α-distroglicano. [15] Los azúcares O-Man separan dos dominios de la proteína, necesarios para conectar las regiones extracelular e intracelular para anclar la célula en su posición. [17] Se pueden agregar ribitol, xilosa y ácido glucurónico a esta estructura en una modificación compleja que forma una larga cadena de azúcar. [8] Esto es necesario para estabilizar la interacción entre el α-distroglicano y la membrana basal extracelular. Sin estas modificaciones, la glicoproteína no puede anclar la célula, lo que conduce a la distrofia muscular congénita (DMC), caracterizada por malformaciones cerebrales graves. [15]

O-Galactosa (O-Gal) Editar

La O-galactosa se encuentra comúnmente en residuos de lisina en el colágeno, que a menudo tienen un grupo hidroxilo agregado para formar hidroxilisina. Debido a esta adición de oxígeno, la hidroxilisina puede modificarse mediante O-glicosilación. La adición de una galactosa al grupo hidroxilo se inicia en el retículo endoplásmico, pero ocurre predominantemente en el aparato de Golgi y solo en residuos de hidroxilisina en una secuencia específica. [1] [18]

Si bien esta O-galactosilación es necesaria para el funcionamiento correcto en todos los colágenos, es especialmente común en los tipos de colágeno IV y V. [19] En algunos casos, se puede agregar un azúcar de glucosa al núcleo de la galactosa. [7]

O-Fucose (O-Fuc) Editar

La adición de azúcares fucosa a los residuos de serina y treonina es una forma inusual de O-glicosilación que ocurre en el retículo endoplásmico y es catalizada por dos fucosiltransferasas. [20] Estos fueron descubiertos en Plasmodium falciparum [21] y Toxoplasma gondii. [22]

Varias enzimas diferentes catalizan el alargamiento de la fucosa central, lo que significa que se pueden agregar diferentes azúcares a la fucosa inicial de la proteína. [20] Junto con la O-glucosilación, la O-fucosilación se encuentra principalmente en los dominios del factor de crecimiento epidérmico (EGF) que se encuentran en las proteínas. [7] O-fucosilación en dominios EGF ocurre entre el segundo y tercer residuos de cisteína conservados en la secuencia de la proteína. [1] Una vez que se ha agregado el núcleo de O-fucosa, a menudo se alarga mediante la adición de GlcNAc, galactosa y ácido siálico.

Notch es una proteína importante en desarrollo, con varios dominios EGF que están O-fucosilados. [23] Los cambios en la elaboración del núcleo de fucosa determinan qué interacciones puede formar la proteína y, por lo tanto, qué genes se transcribirán durante el desarrollo. La O-fucosilación también podría desempeñar un papel en la degradación de proteínas en el hígado. [1]

O-Glucosa (O-Glc) Editar

De manera similar a la O-fucosilación, la O-glucosilación es una modificación inusual ligada a O como ocurre en el retículo endoplásmico, catalizada por O-glucosiltransferasas, y también requiere una secuencia definida para ser agregada a la proteína. La O-glucosa a menudo se une a residuos de serina entre el primer y segundo residuos de cisteína conservados de los dominios EGF, por ejemplo, en los factores de coagulación VII y IX. La [7] O-glucosilación también parece ser necesaria para el plegamiento adecuado de los dominios EGF en la proteína Notch. [24]

Los proteoglicanos consisten en una proteína con una o más cadenas laterales de azúcar, conocidas como glicosaminoglicanos (GAG), unidas al oxígeno de los residuos de serina y treonina. [25] Los GAG consisten en largas cadenas de unidades de azúcar repetidas. Los proteoglicanos se encuentran generalmente en la superficie celular y en la matriz extracelular (MEC), y son importantes para la fuerza y ​​flexibilidad del cartílago y los tendones. La ausencia de proteoglicanos se asocia con insuficiencia cardíaca y respiratoria, defectos en el desarrollo esquelético y aumento de la metástasis tumoral. [25]

Existen diferentes tipos de proteoglicanos, dependiendo del azúcar que está ligado al átomo de oxígeno del residuo en la proteína. Por ejemplo, el heparán sulfato GAG se une a un residuo de proteína serina a través de un azúcar xilosa. [7] La ​​estructura se amplía con varios norte-unidades de azúcares repetidos de acetillactosamina añadidas a la xilosa. Este proceso es inusual y requiere xilosiltransferasas específicas. [6] El sulfato de queratán se adhiere a un residuo de serina o treonina a través de GalNAc y se extiende con dos azúcares de galactosa, seguidos de unidades repetidas de ácido glucurónico (GlcA) y GlcNAc. El sulfato de queratán tipo II es especialmente común en el cartílago. [25]

Los azúcares de galactosa o glucosa se pueden unir a un grupo hidroxilo de lípidos de ceramida en una forma diferente de O-glicosilación, ya que no ocurre en las proteínas. [6] Esto forma glucoesfingolípidos, que son importantes para la localización de receptores en las membranas. [8] La descomposición incorrecta de estos lípidos conduce a un grupo de enfermedades conocidas como esfingolipidosis, que a menudo se caracterizan por neurodegeneración y discapacidades del desarrollo.

Debido a que se pueden agregar azúcares de galactosa y glucosa al lípido de ceramida, tenemos dos grupos de glucoesfingolípidos. Los galactofingolípidos son generalmente de estructura muy simple y el núcleo de galactosa no suele estar modificado. Sin embargo, los glucosfingolípidos a menudo se modifican y pueden volverse mucho más complejos.

La biosíntesis de galacto y glucosfingolípidos ocurre de manera diferente. [6] La glucosa se agrega a la ceramida de su precursor en el retículo endoplásmico, antes de que ocurran más modificaciones en el aparato de Golgi. [8] La galactosa, por otro lado, se agrega a la ceramida ya en el aparato de Golgi, donde el galactofingolípido formado a menudo se sulfata mediante la adición de grupos sulfato. [6]

Uno de los primeros y únicos ejemplos de O-glicosilación en tirosina, más que en residuos de serina o treonina, es la adición de glucosa a un residuo de tirosina en glucogenina. [7] La ​​glicogenina es una glicosiltransferasa que inicia la conversión de glucosa en glucógeno, presente en las células del hígado y del músculo. [26]

Todas las formas de O-glicosilación abundan en todo el cuerpo y desempeñan un papel importante en muchas funciones celulares.

Los epítopos de Lewis son importantes para determinar los grupos sanguíneos y permiten la generación de una respuesta inmune si detectamos órganos extraños. Comprenderlos es importante en los trasplantes de órganos. [1]

Las regiones bisagra de las inmunoglobulinas contienen regiones altamente O-glicosiladas entre dominios individuales para mantener su estructura, permitir interacciones con antígenos extraños y proteger la región de la escisión proteolítica. [1] [8]

El Alzheimer puede verse afectado por la O-glicosilación. Tau, la proteína que se acumula para causar neurodegeneración en el Alzheimer, contiene modificaciones de O-GlcNAc que pueden estar implicadas en la progresión de la enfermedad. [1]

Los cambios en la O-glicosilación son extremadamente comunes en el cáncer. Las estructuras de O-glicanos, y especialmente los epítopos terminales de Lewis, son importantes para permitir que las células tumorales invadan nuevos tejidos durante la metástasis. [6] Comprender estos cambios en la O-glicosilación de las células cancerosas puede conducir a nuevos enfoques de diagnóstico y oportunidades terapéuticas. [1]


Materiales y métodos

Aprobación del estudio y población

La recolección y el uso de toda la saliva para la investigación en este estudio fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad del Noroeste (Xi & # x02019an, China) y el Segundo Hospital Afiliado de la Universidad de Zhengzhou (Zhengzhou, China). Se recibió el consentimiento informado por escrito de los participantes. Y este estudio se llevó a cabo según las directrices éticas de la Declaración de Helsinki. Después de un procedimiento endoscópico estandarizado y una evaluación histopatológica, las personas diagnosticadas con ESCC primaria (n & # x0003d16) se inscribieron en este estudio. Los HV emparejados por edad y sexo (n & # x0003d 25) fueron reclutados en el centro de chequeo médico del mismo hospital donde se sometieron a un reconocimiento médico. Todos los participantes no tuvieron diferencias significativas entre los dos grupos con respecto a las características demográficas, socioeconómicas y de estilo de vida, y los que recibieron radioterapia, quimioterapia, quimiorradioterapia o antibióticos preoperatorios fueron excluidos de este estudio. Las características clínicas de los pacientes con HV y ESCC se resumen en la Tabla 1.

TABLA 1. Información demográfica y clínica de pacientes con ESCC y sujetos con HV en este estudio.

Recolección y preparación de saliva entera

El protocolo de recolección ha sido descrito en literatura previa (Liu et al., 2018 Shu et al., 2018). La saliva completa recolectada se centrifugó a 10.000 sim x000a0ga 4 x000b0C durante 15 x000a0 min para eliminar los componentes insolubles. Y se añadió el cóctel de inhibidor de proteasa (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) al sobrenadante recogido de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y se liofilizó a & # x0221280 & # x000b0C hasta su uso.

Microarrays de lectina y análisis de datos

Las micromatrices de lectinas se produjeron utilizando 37 lectinas con diferentes preferencias de unión que cubren los glicanos ligados a N y O (Shu et al., 2017 Yu et al., 2020b). Las glicoproteínas marcadas con Cy3 se incubaron en el microarray de lectina con rotación suave en la oscuridad (37 & # x000b0C, 3 & # x000a0h). Los microarrays se lavaron con PBST y PBS, respectivamente, se centrifugaron en seco y se escanearon inmediatamente usando un escáner confocal Genepix 4000B (Axon Instruments, Estados Unidos). Las imágenes generadas fueron analizadas por el software Gene pix (versión 6.0, Axon Instruments Inc., Sunnyvale, CA). Expander 6.0 (http://acgt.cs.tau.ac.il/expander/) y Multivariate Statistical Package (Reino Unido) realizaron el análisis de conglomerados jerárquicos promedio no supervisado (HCA) y el análisis de componentes principales (PCA), respectivamente. Y el pag El valor se derivó de la prueba no paramétrica de Mann & # x02013Whitney utilizando el software GraphPad Prism (Versión 7.0, GraphPad Software, Inc., San Diego, CA).

Análisis de transferencia de lectina

Los niveles de expresión de las estructuras de glicanos se analizaron mediante transferencia de lectina como se describió anteriormente (Zhang et al., 2019 Yu et al., 2020b). La proteína salival combinada se separó mediante SDS-PAGE al 10% y se transfirió a una membrana de PVDF (0,22 mm Millipore, Bedford, MA, Estados Unidos). La membrana de PVDF se bloqueó con la solución de bloqueo libre de carbohidratos (Vector Labs, Burlingame, CA) y se incubó con DSA, ECA, LCA, PSA y UEA-I marcados con Cy5, respectivamente. La membrana se escaneó con STORM FluorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, Estados Unidos) y se midió con el software ImageJ (NIH).

Preparación de conjugados de partículas magnéticas DSA

Las partículas magnéticas recubiertas con epoxi (2 & # x000a0 mg) se enjuagaron con etanol y tampón de acoplamiento (5 & # x000a0mM NaB4O7, 180 & # x000a0mM H3BO4, 150 & # x000a0mM Na & # x0002b, pH 7,4), respectivamente, y reaccionaron con una solución de DSA (DSA se disuelve en tampón de acoplamiento) de acuerdo con el protocolo (Zhang et al., 2019 Yang et al., 2020b). Luego, los conjugados se lavaron con un tampón de acoplamiento para eliminar las lectinas no unidas.

Aislamiento selectivo de fracciones de glicoproteínas de la saliva mediante conjugados de partículas magnéticas DSA

Las glicoproteínas que contienen GlcNAc y Gal & # x003b21-4GlcNAc se aislaron de pacientes con ESCC y HV utilizando conjugados de partículas magnéticas DSA como se describió anteriormente (Zhang et al., 2019 Yang et al., 2020b). Brevemente, la proteína salival combinada se diluyó con el tampón de unión (100 & # x000a0 Mm Tris-HCl 150 & # x000a0mM NaCl 1 & # x000a0mM CaCl2, MgCl2y MnCl2 pH 7,4) y se incubó con los conjugados DSA (temperatura ambiente, 3 & # x000a0h). Después de 3 & # x000a0h de agitación suave, los conjugados se lavaron usando tampón de lavado (0,1% Tween-20 en tampón de unión, pH 7,2) para eliminar las proteínas no unidas, y las glicoproteínas unidas a los conjugados se eluyeron con un tampón de elución (8 & # x000a0M urea , 40 & # x000a0mM NH4HCO3).

Aislamiento y purificación de glicanos ligados a N

El aislamiento y la purificación de N-glicanos se realizaron con base en métodos descritos anteriormente (Qin et al., 2017 Yang et al., 2020b). Las glicoproteínas se concentraron y desalaron mediante unidades de ultrafiltración Amicon Ultra-0.5 3 & # x000a0KDa (Millipore, Estados Unidos) y luego se desnaturalizaron mediante la adición de urea 8 & # x000a0M, DTT 10 & # x000a0mM y IAM 10 & # x000a0mM. Las glicoproteínas desnaturalizadas se intercambiaron por NH 40 & # x000a0 mM4HCO3 tampón y se incubó con tripsina (37 ° C, durante la noche). La tripsina de la mezcla se inactivó calentando (80 ° C, 5 ° C, 5 ° C, 5 ° C, 5 ° C, 5 ° C, 5 ° C, 5 ° C, 5 ° C, 5 ° C, 5 ° C, 5 ° C, 5 ° C, 5 ° C, 5 ° C, 5 ° C, 5 ° C, 5 ° C, 5 ° C, 5 ° C, 5 ° C, 5 ° C, 5 ° C, 5 ° C, 5 ° C, 5 ° C, 5 ° C) y luego se añadió PNGasa F (New England Biolabs, Beverly, MA) para liberar los N-glicanos (37 ° C, 5 ° C, durante la noche). Posteriormente, la digestión se sometió a cartuchos HyperSep Hypercarb SPE (25 & # x000a0 mg, 1 & # x000a0mL Thermo Scientific) para eliminar los péptidos. Los N-glicanos purificados se recogieron y liofilizaron.

Caracterización de N-Glicanos por MALDI-TOF / TOF-MS

Los N-glicanos se caracterizaron por espectroscopía de masas de tiempo de vuelo / tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF / TOF-MS, UltrafleXtreme, Bruker Daltonics Bremen, Alemania) como se describió anteriormente (Qin et al. ., 2017 Zhang et al., 2019 Yang et al., 2020b). Los glicanos se resuspendieron y se colocaron en un objetivo de muestra MTP AnchorChip. Luego, 2 & # x000a0 & # x003bcL de 10 & # x000a0mg / mL ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) con 1 & # x000a0mM NaCl en una solución de metanol al 50% (v / v) se mancharon para recristalizar los N-glicanos y se secaron al vacío para su análisis. . Se utilizaron patrones de calibración de péptidos (250 puntos de calibración Bruker) como calibración de masa. Se realizó el modo de reflexión de iones positivos y se analizó un intervalo de masas de 1.000 & # x020134.000 & # x000a0Da. Se generaron y anotaron espectros de MS representativos de picos de masa de N-glucanos con una relación señal / ruido superior a tres utilizando el software FlexAnalysis y GlycoWorkbench.


Información del autor

Afiliaciones

Departamento de Microbiología, Universidad de Cornell, Ithaca, NY, EE. UU.

Aravind Natarajan, Marielisa Cabrera-Sánchez y Matthew P. DeLisa

Escuela de Ingeniería Química y Biomolecular Robert F. Smith, Universidad de Cornell, Ithaca, NY, EE. UU.

Thapakorn Jaroentomeechai, Jody C. Mohammed, Olivia Young, Michael Vilkhovoy, Sandra Vadhin, Jeffrey D. Varner y Matthew P. DeLisa

Ciencias Biomédicas y Biológicas, Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Cornell, Ithaca, NY, EE. UU.

Emily C. Cox y Matthew P. DeLisa

Centro de Investigación de Carbohidratos Complejos, Universidad de Georgia, Athens, GA, EE. UU.

Asif Shajahan y amp Parastoo Azadi

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Contribuciones

UN. diseñó y realizó toda la investigación, analizó todos los datos y redactó el artículo. T.J. diseñó y realizó investigaciones relacionadas con la glicosilación libre de células y analizó datos. M.C.-S. y O.Y. realizó investigaciones relacionadas con la construcción y prueba de vías biosintéticas de glucanos. J.C.M. realizó investigaciones relacionadas con la prueba de diferentes proteínas para la glicosilación. E.C.C. realizó investigaciones relacionadas con la detección basada en anticuerpos de diferentes glicoformas de MUC1. A.S., M.V., S.V., J.D.V. y P.A. realizó análisis de espectrometría de masas y ayudó en la interpretación de datos. M.P.D. dirigió la investigación, analizó los datos y redactó el manuscrito.

Autor correspondiente


Kit de desglicosilación química GlycoProfile ™ IV

El kit de desglicosilación química GlycoProfile IV optimizado elimina los glucanos de las glucoproteínas utilizando ácido trifluorometanosulfónico (TFMS). A continuación, la proteína desglicosilada se puede recuperar usando un método de procesamiento posterior adecuado, como filtración en gel o diálisis. A diferencia de otros métodos de desglicosilación química, la hidrólisis con TFMS anhidro es muy eficaz para eliminar los glicanos ligados a O y N (excepto la GlcNAc ligada a Asn más interna de los glicanos ligados a N) con una degradación mínima de la proteína. El grado de desglicosilación puede evaluarse mediante el cambio de movilidad de la proteína desglicosilada frente a la glicoproteína intacta en geles SDS-PAGE (Figura 5).

Figura 5. Análisis de la desglicosilación química de RNasa B en gel SDS-PAGE homogéneo al 12%. El carril 1 es el control de RNasa B (producto nº R1153), mientras que los carriles 2 a 5 representan fracciones recogidas de la columna de filtración de gel. Los carriles 2 y 3 son fracciones de volumen pre-vacío y los carriles 4 y 5 muestran bandas a 13,5 kDa, correspondientes a la RNAsa B desglicosilada.

  • Cada reacción procesa 1-2 mg de glicoproteína - Salida suficiente para el análisis posterior
  • Degradación mínima del núcleo proteico - Para obtener datos de MS más fiables
  • Desglicosilación completa en tan solo 30 minutos - Para un mayor rendimiento

Agradecemos al Prof. Malcolm McCrae por la corrección de pruebas, al Dr. David Clark por el mantenimiento del espectrómetro de masas Fusion Lumos ya Angellina Song por el apoyo técnico. Reconocemos el servicio de Johns Hopkins Mass Spectrometry and Proteomics Core. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (R21AI122382), el Instituto Nacional del Cáncer, la Red de Investigación de Detección Temprana (EDRN, U01CA152813), el Consorcio de Análisis Clínico Proteómico de Tumores (CPTAC, U24CA210985), Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y la Sangre, Programas de Excelencia en Glicociencias (PEG, P01HL107153), y amfAR, La Fundación para la Investigación del SIDA para llevar a los bioingenieros a curar el VIH (subvención amfAR 109551-61-RGRL). El siguiente reactivo se obtuvo a través del Programa de Reactivos para el SIDA de los NIH, División de SIDA, NIAID, NIH: células CEM CD4 + del Dr. J.P. Jacobs.

WY y HZ concibieron el concepto y escribieron el manuscrito WY realizaron análisis experimentales WY, MA y YH realizaron programación, análisis de datos y bioinformática WY e YH desarrollaron una estrategia para la identificación de glicopéptidos QKL recolectados y realizaron un examen patológico de tumores y tejidos renales normales.


Modificaciones postraduccionales que modulan la actividad enzimática

Fangxu Sun, Ronghu Wu, en Métodos en enzimología, 2019

Abstracto

Las glicoproteínas en la superficie celular son esenciales para diversas actividades celulares, incluida la comunicación célula-célula y la interacción célula-matriz. Las alteraciones de la glicosilación están correlacionadas con muchas enfermedades como el cáncer y las enfermedades infecciosas. Sin embargo, es un gran desafío analizar de manera sistemática y especial las glicoproteínas que solo se encuentran en la superficie celular debido a la heterogeneidad de los glicanos, la baja abundancia de muchas glicoproteínas de superficie y el requisito de métodos efectivos para separar las glicoproteínas de superficie. En este capítulo, revisamos brevemente los métodos existentes basados ​​en espectrometría de masas (MS) para el análisis global de glicoproteínas de superficie. Luego discutimos un método efectivo que integra el etiquetado metabólico, las reacciones enzimáticas y de clic, y la proteómica basada en MS para investigar de manera integral y específica el sitio N-glicoproteínas de la superficie celular. También se incluye un protocolo detallado para este método. En combinación con la proteómica cuantitativa, aplicamos este método para cuantificar las N-glucoproteínas de la superficie celular y estudiar la relación entre la invasividad celular y las N-sialoglicoproteínas en la superficie celular. Teniendo en cuenta la importancia de las glicoproteínas de superficie, este método se puede aplicar ampliamente para avanzar en la glicosciencia, lo que conduce a una mejor comprensión de los mecanismos moleculares de las enfermedades humanas y al descubrimiento de glicoproteínas de superficie como biomarcadores para la detección de enfermedades.


11.3.7. Los oligosacáridos pueden ser & # x0201cSequenced & # x0201d

Dada la gran diversidad de estructuras de oligosacáridos y los muchos puntos posibles de unión a la mayoría de las proteínas, ¿cómo es posible determinar la estructura de una glicoproteína? La mayoría de los enfoques se basan en el uso de enzimas que escinden oligosacáridos en tipos específicos de enlaces. Por ejemplo, norteLos oligosacáridos ligados pueden ser liberados de las proteínas por una enzima como el péptido. norte-glicosidasa F, que escinde la norte-Los enlaces glucosídicos que unen el oligosacárido a la proteína. A continuación, los oligosacáridos pueden aislarse y analizarse. Mediante el uso de MALDI-TOF u otras técnicas de espectrometría de masas (Sección 4.1.7), se puede determinar la masa de un fragmento de oligosacárido. Sin embargo, dado el gran número de combinaciones de monosacáridos potenciales, muchas estructuras de oligosacáridos posibles son consistentes con una masa dada. Se puede obtener información más completa escindiendo el oligosacárido con enzimas de diferentes especificidades. Por ejemplo, la & # x003b2-1,4-galactosidasa escinde los enlaces & # x003b2-glucosídicos exclusivamente en los residuos de galactosa. Los productos se pueden analizar nuevamente mediante espectrometría de masas (Figura 11.27). La repetición de este proceso con el uso de una serie de enzimas de diferente especificidad eventualmente revelará la estructura del oligosacárido.

Figura 11.27

Espectrometría de masas y secuenciación de oligosacáridos. Se utilizaron enzimas de escisión de carbohidratos para liberar y escindir específicamente el componente oligosacárido de la glicoproteína fetuina del suero bovino. Las partes A y B muestran las masas obtenidas (más.)

Los puntos de unión de oligosacáridos se pueden determinar mediante el uso de proteasas. La escisión de una proteína mediante la aplicación de proteasas específicas produce un patrón característico de fragmentos de péptidos que pueden analizarse cromatográficamente (Sección 4.2.1). Las propiedades cromatográficas de los péptidos unidos a los oligosacáridos cambiarán con el tratamiento con glicosidasa. Mass spectrometric analysis or direct peptide sequencing can reveal the identity of the peptide in question and, with additional effort, the exact site of oligosaccharide attachment.

Posttranslational modifications such as glycosylation greatly increase the complexity of the proteome. A given protein with several potential glycosidation sites can have many different glycosylated forms (sometimes called glycoforms), each of which may be generated only in a specific cell type or developmental stage. Now that the sequencing of the human genome is essentially complete, the characterization of the much more complex proteome, including the biological roles of specifically modified proteins, can begin in earnest.

De acuerdo con el editor, se puede acceder a este libro mediante la función de búsqueda, pero no se puede navegar.


Ver el vídeo: Matriz Extracelular: Glicosaminoglicanos, Proteoglicanos, Glicoproteínas, Colágeno e Elastina (Enero 2022).