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¿Por qué un plásmido de vector de mamífero requeriría un gen de resistencia a los antibacterianos?


He estado tratando de comprender la composición de los plásmidos utilizados en la clonación de ADN recombinante, como este: https://www.genecopoeia.com/wp-content/uploads/2020/02/pReceiver-M35-051818.pdf y estoy preguntándose qué propósito tiene el gen de resistencia a la ampicilina cuando se transfecta en una célula huésped de mamífero (como dice que es).
Entiendo que la resistencia a la ampicilina se usa para la selección en células bacterianas de modo que solo se cultiven bacterias transformadas y se necesite ampicilina para prevenir la contaminación bacteriana entre un cultivo de células de mamíferos, pero no veo por qué las células de mamíferos requieren un gen de resistencia a un antibiótico.

Gracias


Creo que la suposición que está haciendo es que el gen de resistencia a la ampicilina salvaría un propósito en las células de los mamíferos. No es asi.

Como dijiste, solo se usa durante el proceso de clonación para seleccionar las bacterias que se replicarán y producirán más.

Hay un gen de resistencia en el vector que publicaste que afecta a las células de mamíferos: la neomicina. En este caso, una vez transfectadas en células de mamíferos, podría seleccionar solo las células con el plásmido agregando neomicina al medio de cultivo celular.

Nota: la selección de neomicina puede llevar algún tiempo (4-5 días) y una dosis más alta que, por ejemplo, la puromicina. ¡Espero que esto ayude!


Tecnología de clonación molecular y ADN recombinante

Tipos de vectores

Vectores de clonación proporcionan una columna vertebral para que el inserto de ADN se reproduzca y propague en bacterias, sin embargo, estos vectores solo son útiles para almacenar una secuencia genética. Por sí mismos, son incapaces de permitir la transcripción y traducción del gen en un producto proteico funcional.

Para que un gen dé lugar a un producto proteico, vector de expresión Debe utilizarse que contenga los elementos necesarios para que una célula huésped transcriba y traduzca el gen. En el caso de una célula de mamífero, un vector de expresión de mamífero estándar contendrá un origen de replicación, MCS y un marcador seleccionable, como se describió anteriormente. Sin embargo, el vector de expresión también necesitará un promotor que se encuentra en células de mamíferos que pueda impulsar la expresión del gen. El ADN codificante necesita otras características para ser transcrito y traducido, como la cola de poliadenilación que normalmente aparece al final del pre-ARNm transcrito y una secuencia que atrae el ribosoma para la traducción.


Términos clave

  • plásmido: Un círculo de ADN de doble hebra que está separado de los cromosomas, que se encuentra en bacterias y protozoos.
  • vector de expresión: Un vector de expresión, también conocido como construcción de expresión, es generalmente un plásmido que se usa para introducir un gen específico en una célula diana.
  • transcripción: La síntesis de ARN bajo la dirección de ADN.

Un vector de expresión, también conocido como construcción de expresión, es generalmente un plásmido que se usa para introducir un gen específico en una célula diana. Una vez que el vector de expresión está dentro de la célula, la proteína codificada por el gen es producida por los complejos ribosomales de la maquinaria de traducción y transcripción celular. El plásmido se modifica con frecuencia para contener secuencias reguladoras que actúan como regiones potenciadoras y promotoras y conducen a una transcripción eficaz del gen transportado por el vector de expresión. El objetivo de un vector de expresión bien diseñado es la producción de grandes cantidades de ARN mensajero estable y, en extensión, proteínas. Los vectores de expresión son herramientas básicas para la biotecnología y la producción de proteínas como la insulina, que es importante para el tratamiento de la diabetes.

Figura: El plásmido pGEX-3x: El plásmido pGEX-3x es un vector de clonación popular. Tenga en cuenta la presencia de un sitio de clonación múltiple, un promotor, un represor y un marcador seleccionable.

Después de la expresión del producto génico, se requiere la purificación de la proteína, pero dado que el vector se introduce en una célula huésped, la proteína de interés debe purificarse a partir de las proteínas de la célula huésped. Por lo tanto, para facilitar el proceso de purificación, el gen clonado debe tener una etiqueta. Esta etiqueta podría ser una etiqueta de histidina (His) o cualquier otro péptido marcador.

Los vectores de expresión se utilizan para técnicas de biología molecular tales como mutagénesis dirigida al sitio. Los vectores de clonación, que son muy similares a los vectores de expresión, implican el mismo proceso de introducción de un nuevo gen en un plásmido, pero luego el plásmido se agrega a las bacterias con fines de replicación. En general, los vectores de ADN que se utilizan en muchos experimentos de clonación de genes de biología molecular no necesitan dar como resultado la expresión de una proteína.

Los vectores de expresión deben tener señales de expresión tales como un promotor fuerte, un codón de terminación fuerte, ajuste de la distancia entre el promotor y el gen clonado, y la inserción de una secuencia de terminación de la transcripción y una PTIS (secuencia de inicio de traducción portátil).

Un vector lanzadera es un vector que puede propagarse en dos especies diferentes de hospedadores, por lo tanto, el ADN insertado se puede probar o manipular en dos tipos de células diferentes. La principal ventaja de estos vectores es que pueden manipularse en E. coli y luego usarse en un sistema que es más difícil o más lento de usar.

Los vectores lanzadera se pueden utilizar tanto en eucariotas como en procariotas. Los vectores lanzadera se utilizan con frecuencia para hacer rápidamente múltiples copias del gen en E. coli (amplificación). También se pueden utilizar para experimentos in vitro y modificaciones como mutagénesis y PCR. Uno de los tipos más comunes de vectores lanzadera es el vector lanzadera de levadura que contiene componentes que permiten la replicación y selección tanto en células de E. coli como en células de levadura. El componente de E. coli de un vector lanzadera de levadura incluye un origen de replicación y un marcador seleccionable, como una resistencia a antibióticos como la beta lactamasa. El componente de levadura de un vector lanzadera de levadura incluye una secuencia de replicación autónoma (ARS), un centrómero de levadura (CEN) y un marcador seleccionable de levadura.


El plásmido modificado genéticamente se puede utilizar para combatir la resistencia a los antimicrobianos.

Los investigadores han diseñado un plásmido para eliminar un gen de resistencia a los antibióticos del Enterococcus faecalis bacteria, un logro que podría conducir a nuevos métodos para combatir la resistencia a los antibióticos. La investigación se publica esta semana en Agentes antimicrobianos y quimioterapia, una revista de la Sociedad Estadounidense de Microbiología.

In vitro y en modelos de ratón, el plásmido modificado eliminó el gen de resistencia a antibióticos de E. faecalis. En modelos de ratón, redujo tres veces la abundancia del gen de resistencia.

"Nuestra preocupación por los organismos que causan infecciones adquiridas en el hospital que son resistentes a muchas terapias clínicas con antibióticos motivó la investigación", dijo el coautor principal Breck A. Duerkop, PhD, profesor asistente de inmunología y microbiología de la Facultad de medicina de la Universidad de Colorado. Centro Médico Anschutz, Aurora.

E. faecalis es parte de la flora intestinal normal y benigna, pero cuando los antibióticos matan la flora intestinal beneficiosa, E. faecalis puede volverse patógeno. Como tal, también puede adquirir resistencia a uno o varios fármacos. Resistente a los antibióticos E. faecalis las infecciones son un problema importante en los hospitales.

El mecanismo utilizado para eliminar los genes de resistencia a los antibióticos es la proteína especializada CRISPR-Cas9. Puede hacer cortes en casi cualquier parte del ADN.

Junto con CRISPR-Cas9, se han agregado al plásmido diseñado secuencias de ARN homólogas al ADN dentro del gen de resistencia a antibióticos. Estos ARN guían al CRISPR-Cas9 para realizar los cortes en los lugares correctos.

El trabajo previo en modelos animales por el co-investigador principal Kelli L. Palmer, PhD, encontró que CRISPR-Cas9 podría prevenir E. faecalis de adquirir genes de resistencia. El Dr. Palmer es miembro de la Cátedra Cecil H. e Ida Green en Ciencias de Biología de Sistemas, Profesor Asociado de Ciencias Biológicas, Universidad de Texas, Dallas.

El vehículo de suministro para el plásmido diseñado es una cepa particular de E. faecalis, que se conjuga con E. faecalis de varias cepas diferentes. La conjugación es el proceso mediante el cual las bacterias se unen para transferir material genético de una a otra a través del contacto directo de célula a célula.

"E. faecalis cepas utilizadas para administrar estos plásmidos a cepas resistentes a los fármacos [de E. faecalis] son ​​inmunes a adquirir rasgos de resistencia a los medicamentos que llevan las células diana ", dijo el Dr. Duerkop." El plásmido diseñado puede reducir significativamente la aparición de resistencia a los antibióticos en la población bacteriana diana haciéndola más susceptible a los antibióticos. Prevemos que este tipo de sistema podría usarse para volver a sensibilizar a los antibióticos E. faecalis a los antibióticos ", dijo.

No obstante, el Dr. Duerkop advirtió que seguía siendo posible que E. faecalis todavía podría eludir el plásmido diseñado. Algunas bacterias tienen sistemas anti-CRISPR que pueden bloquear la función CRISPR-Cas9 y otras tienen sistemas que pueden degradar el ADN extraño. "Será necesario realizar estudios futuros para abordar un problema como E. faecalis evitando el sistema de focalización y bajo qué condiciones esto puede suceder ", dijo el Dr. Duerkop.


Diseño de vectores de plásmido

Los vectores de terapia génica no virales se basan comúnmente en plásmidos bacterianos recombinantes o sus derivados. Los plásmidos se propagan en bacterias, por lo que, además de su carga terapéutica, contienen necesariamente un origen de replicación bacteriano y un marcador de selección, generalmente un gen que confiere resistencia a los antibióticos. La estabilidad del plásmido estructural y de mantenimiento en bacterias es necesaria para la producción de ADN plasmídico y se puede lograr eligiendo cuidadosamente una combinación de secuencias terapéuticas de ADN, origen de replicación, marcador de selección y cepa bacteriana. El uso de promotores apropiados, otros elementos reguladores y dispositivos de mantenimiento de mamíferos asegura que el gen o genes terapéuticos se expresen adecuadamente en las células humanas diana. La respuesta inmune óptima a los vectores plasmídicos se puede modular mediante la inclusión o exclusión de secuencias de ADN que contienen motivos de secuencia CpG inmunoestimuladores. Los fragmentos de ADN que facilitan la construcción de vectores plasmídicos también deben considerarse para su inclusión en el diseño de vectores plasmídicos. Se prefieren las técnicas que se basan en la recombinación homóloga o específica del sitio para la construcción de plásmidos grandes (& gt15 kb), mientras que la digestión del ADN por enzimas de restricción con ligación posterior de los fragmentos de ADN resultantes sigue siendo el enfoque principal para la generación de pequeños y medianos- plásmidos de tamaño. La selección rápida de un plásmido recombinante deseado frente a otros plásmidos continúa siendo un desafío. En este capítulo, se hace hincapié en las versiones eficientes y flexibles de los protocolos de clonación de ADN que utilizan la selección de plásmidos recombinantes mediante endonucleasas de restricción directamente en la mezcla de ligación.


Ingeniería genética en plantas

Debido a su importancia económica, las plantas han sido durante mucho tiempo objeto de análisis genéticos destinados a desarrollar variedades mejoradas. La tecnología del ADN recombinante ha introducido una nueva dimensión en este esfuerzo porque las modificaciones del genoma que esta tecnología posibilita son casi ilimitadas. La cría ya no se limita a seleccionar variantes dentro de una especie determinada. Ahora se puede introducir ADN de otras especies de plantas, animales o incluso bacterias.

Plásmido Ti. & # X02003 & # x02003

Los únicos vectores que se utilizan habitualmente para producir plantas transgénicas se derivan de una bacteria del suelo llamada Agrobacterium tumefaciens. Esta bacteria causa lo que se conoce como enfermedad de la agalla de la corona, en el que la planta infectada produce crecimientos incontrolados (tumores o agallas), normalmente en la base (corona) de la planta. La clave para la producción de tumores es un plásmido de ADN circular grande (200 kb) y el plásmido Ti (inductor de tumores). Cuando la bacteria infecta una célula vegetal, una parte del plásmido Ti & # x02014 una región llamada T-DNA & # x02014 se transfiere e inserta, aparentemente más o menos al azar, en el genoma de la planta huésped (Figura 13-14 ). Las funciones necesarias para esta transferencia están fuera del T-DNA en el plásmido Ti. El T-DNA en sí mismo tiene varias funciones interesantes, incluida la producción del tumor y la síntesis de compuestos llamados opina. En realidad, las opiniones se sintetizan en la planta huésped bajo la dirección del T-DNA. Luego, la bacteria usa las opiniones para sus propios fines, invocando genes que utilizan la opinión en el plásmido Ti. Dos opiniones importantes son la nopalina y la octopina, dos plásmidos Ti separados las producen. La estructura de Ti se muestra en la Figura 13-15.

Figura 13-14

En el proceso de causar la enfermedad de la agalla de la corona, la bacteria A. tumefaciens inserta una parte de su plásmido Ti & # x02014 una región llamada T-DNA & # x02014 en un cromosoma de la planta huésped.

Figura 13-15.

Representación simplificada de las principales regiones del plásmido Ti de A. tumefaciens. El T-ADN, cuando se inserta en el ADN cromosómico de la planta huésped, dirige la síntesis de nopalina, que luego es utilizada por la bacteria para sus propios fines. T-DNA (más.)

El comportamiento natural del plásmido Ti lo hace muy adecuado para el papel de un vector vegetal. Si el ADN de interés pudiera empalmarse en el T-ADN, entonces todo el paquete se insertaría en un estado estable en un cromosoma de la planta. De hecho, este sistema se ha hecho funcionar esencialmente de esta manera, pero con algunas modificaciones necesarias. Examinemos un protocolo.

Los plásmidos Ti son demasiado grandes para manipularlos fácilmente y no pueden hacerse más pequeños fácilmente porque contienen pocos sitios de restricción únicos. En consecuencia, un vector intermedio más pequeño recibe inicialmente el inserto de interés y los otros genes y segmentos necesarios para la recombinación, la replicación y la resistencia a los antibióticos. Cuando se diseña con los elementos genéticos deseados, este vector intermedio se puede insertar en el plásmido Ti, formando un plásmido cointegrado que se puede introducir en una célula vegetal mediante transformación. La figura 13-16a muestra un método para crear el cointegrado. El plásmido Ti que recibirá el vector intermedio se atenúa primero, es decir, tiene toda la región derecha de su ADN-T, incluidos los genes tumorales y los genes de síntesis de nopalina, eliminados, lo que lo vuelve incapaz de formar tumores. & # x0201cnuisance & # x0201d aspecto de la función del T-DNA. Conserva el borde izquierdo de su T-DNA, que se utilizará como sitio de cruce para la incorporación del vector intermedio. El vector intermedio ha tenido un conveniente segmento de clonación empalmado, que contiene una variedad de sitios de restricción únicos. El gen de interés se ha insertado en este sitio en la figura 13-16. También se empalma en el vector un gen bacteriano seleccionable (spc R) para la resistencia a la espectinomicina, un gen bacteriano de resistencia a la kanamicina (kan R), diseñado para la expresión en plantas y dos segmentos de T-DNA. Un segmento lleva el gen de síntesis de nopalina. (nos) más la secuencia del borde del ADN-T de la derecha. El segundo segmento de ADN-T proviene cerca del borde izquierdo y proporciona una sección para la recombinación con una parte homóloga de la región del lado izquierdo, que se retuvo en el plásmido Ti desarmado. Después de que los vectores intermedios se hayan introducido en Agrobacterium células que contienen los plásmidos Ti desarmados (por conjugación con E. coli), los plásmidos recombinantes (cointegrados) pueden seleccionarse mediante placa sobre espectinomicina. Las colonias bacterianas seleccionadas contendrán solo el plásmido Ti, porque el vector intermedio es incapaz de replicarse en Agrobacterium.

Figura 13-16.

(a) Para producir plantas transgénicas, se usa un vector intermedio de tamaño manejable para clonar el segmento de interés. En el método que se muestra aquí, el vector intermedio luego se recombina con un plásmido Ti atenuado (& # x0201cdisarmed & # x0201d) para generar (más.)

Como muestra la Figura 13-16b, después de la selección con espectinomicina para los cointegrados, las bacterias que contienen el plásmido doble recombinante, o cointegrante, se utilizan para infectar segmentos cortados de tejido vegetal, tales como discos de hojas perforados. Si se produce una infección bacteriana de las células vegetales, se puede insertar en los cromosomas de la planta cualquier material genético entre las secuencias del borde del ADN-T izquierdo y derecho. Si los discos de las hojas se colocan en un medio que contiene kanamicina, las únicas células vegetales que se someterán a la división celular son las que han adquirido la kan Gen R de la transferencia de T-DNA. El crecimiento de tales células da como resultado un grupo o callo, lo que es una indicación de que se ha producido una transformación. Estos callos pueden inducirse a formar brotes y raíces, momento en el que se transfieren al suelo donde se convierten en plantas transgénicas (Figura 13-16b). A menudo, solo se detecta un inserto de ADN-T en tales plantas, donde se segrega en la meiosis como un alelo mendeliano normal (figura 13-17). El inserto se puede detectar mediante una sonda de ADN-T en una hibridación Southern o se puede verificar mediante la detección de la nopalina química en el tejido transgénico.

Figura 13-17

El T-ADN y cualquier ADN contenido en él se insertan en un cromosoma vegetal en la planta transgénica y luego se transmiten en un patrón de herencia mendeliano.

Expresión de ADN clonado

El ADN clonado en el ADN-T puede ser cualquier ADN que el investigador desee insertar en la planta en cuestión. Un ADN extraño particularmente sorprendente que se ha insertado con el uso de T-ADN es el gen de la enzima luciferasa, que se aísla de las luciérnagas. La enzima cataliza la reacción de una sustancia química llamada luciferina con ATP en este proceso, se emite luz, lo que explica por qué las luciérnagas brillan en la oscuridad. Una planta de tabaco transgénica que expresa el gen de la luciferasa también brillará en la oscuridad cuando se riegue con una solución de luciferina (vea la fotografía al comienzo de este capítulo). Tal manipulación puede parecer un intento de desarrollar tecnología para hacer árboles de Navidad que no necesitan luces, pero de hecho el gen de la luciferasa es útil como reportero para monitorear la función de cualquier gen durante el desarrollo. En otras palabras, las secuencias promotoras cadena arriba de cualquier gen de interés pueden fusionarse con el gen de la luciferasa y colocarse en una planta mediante T-DNA. Entonces, el gen de la luciferasa seguirá el mismo patrón de desarrollo que el del gen normalmente regulado, pero el gen de la luciferasa anunciará su actividad de manera prominente brillando en varios momentos o en varios tejidos, dependiendo de la secuencia reguladora.

Otros genes utilizados como indicadores en las plantas son los bacterianos. GUS (& # x003b2-glucuronidasa), que convierte el compuesto X-Gluc en azul y la bacteria laca (& # x003b2-galactosidasa) gen, que vuelve azul X-Gal.Las células en las que se expresan estos reporteros se vuelven azules, y este color azul se puede ver fácilmente a simple vista o bajo el microscopio.

Actualmente se utilizan plantas transgénicas que portan cualquiera de una variedad de genes extraños, y se están desarrollando muchas más. No sólo se manipulan las cualidades de las plantas, sino que, al igual que los microorganismos, las plantas también se utilizan como & # x0201cfactories & # x0201d convenientes para producir proteínas codificadas por genes extraños.


¿Por qué un plásmido de vector de mamífero requeriría un gen de resistencia a los antibacterianos? - biología

Un impulso importante del desarrollo de vectores ha sido crear vectores que manejen insertos de ADN extraño más grandes, con el objetivo de reducir el número de recombinantes que es necesario observar para identificar una secuencia de ADN específica.

Vectores de cosmid estuvieron entre los primeros vehículos de clonación de insertos grandes desarrollados.

El vector se replica como un plásmido.
(contiene un origen de replicación ColE1),
usa Amp r para la selección positiva y
emplea empaquetamiento de fagos lambda para seleccionar plásmidos recombinantes que llevan insertos de ADN extraño de 45 KB de tamaño.

La ligación del vector cósmido y los fragmentos de ADN extraños (fragmentos de digestión parcial de SauIIIA de 45 kb de tamaño) es similar a la ligación en un vector de sustitución lambda.
El producto de ligadura deseado es un concatémero de
Fragmento de ADN extraño de 45 kb y secuencias de vector cósmido de 5 kb.

Este concatémero se empaqueta luego en partículas virales (recuerde que el empaquetamiento es de un sitio cos a otro) y se usan para infectar E. coli donde el vector cósmido se replica usando la orignina de replicación ColE1. El empaquetamiento de fagos solo sirve para seleccionar moléculas recombinantes y para transferir estas moléculas de ADN largas (50 kb en total) al hospedador bacteriano (los fragmentos de 50 kb se transforman de manera muy ineficaz, mientras que la infección por fagos es muy eficiente).

Recientemente, la necesidad de vectores procarióticos capaces de replicar fragmentos de ADN extraños muy grandes
(& gt 1 MB de tamaño) ha producido un par de sistemas de vectores procarióticos adicionales.
Uno se basa en otro bacteriófago llamado P1.
El fago P1 puede transportar más de 100 KB de ADN extraño, pero no parece haber encontrado una amplia aceptación.

Hace unos años, se desarrolló un vector de cromosoma artificial bacteriano (BAC) que permite la propagación de fragmentos de ADN extraño de más de 1 MB en E. coli.
Estos vectores BAC se replican como plásmidos de bajo número de copias (para minimizar las demandas del sistema de replicación del huésped), pero ¿cómo podemos obtener fragmentos de ADN tan grandes en E. coli?

Los métodos estándar para transformar E coli se basan en la preparación química de E coli para ponerlos en un estado de "transformación competente".
Por lo general, esto implica incubar las bacterias en presencia de cationes divalentes (particularmente Ca +2) a baja temperatura (4 o C), lo que pone la membrana celular en un 'estado semicristalino'. La adición de ADN a estas "células competentes" permite que el ADN se una a la membrana semicristalina. El choque térmico de las células (42 o C) removiliza la membrana y permite que el ADN atraviese la membrana. Este tránsito a través de la membrana es sensible a la longitud del ADN: los plásmidos pequeños atraviesan la membrana rápidamente mientras que las moléculas más grandes no pueden cruzar.

Hacer que moléculas muy grandes atraviesen la membrana celular depende de un mecanismo alternativo llamado electroporación. Esto implica mezclar ADN con células de E. coli y luego exponer la mezcla a un pulso de alto voltaje. El alto voltaje induce reordenamientos masivos de la membrana y la captación coincidente de ADN, que es independiente del tamaño. Los BAC han sido una herramienta importante para el proyecto de secuenciación del genoma humano.

Se han desarrollado numerosos sistemas de vectores para su uso en sistemas eucariotas.
Los más comunes de estos a menudo se denominan 'vectores de lanzadera'ya que se replican tanto en huéspedes procariotas como eucariotas. En general, las manipulaciones y caracterizaciones del ADN se realizan en sistemas procariotas, y luego el ADN manipulado se reintroduce en sistemas eucariotas para su análisis funcional.

Vectores de levadura
Los vectores lanzadera se desarrollaron por primera vez para transferir fragmentos de ADN entre E. coli y S. cerevisiae. Estos vectores contienen un gen de resistencia a antibióticos para la selección positiva en E. coli, y el origen de replicación de E. coli (ColE1 ori), y un polienlazador en el fragmento complementario de lacZ alfa para la inactivación por inserción por el inserto de ADN extraño. Además, el vector contiene un origen de replicación específico de levadura (derivado del plásmido de levadura natural llamado círculo de 2 um - 2um ori)
y enzimas de biosíntesis de aminoácidos o N-bases para la selección positiva en levadura (genes HIS, LEU y ADE)

Vectores de mamíferos
También se han desarrollado vectores lanzadera para su uso en cultivos de tejidos de mamíferos.
Al igual que los vectores lanzadera de levadura, los vectores lanzadera de mamíferos requieren secuencias que les permitan replicarse en cultivos de tejidos de mamíferos. Estos orígenes de replicación eucariotas se derivan típicamente de virus de mamíferos bien caracterizados, más comúnmente SV-40 (sistema de antígeno ori y T grande de SV-40) o virus de Epstein-Barr (mononucleosis). Ambos sistemas permiten que el vector se replique dentro de la célula huésped como un plásmido sin integrarse en el genoma. Además del origen de replicación, estos vectores lanzadera también llevan genes de resistencia a antibióticos que funcionan en células eucariotas (es decir, resistencia a neomicina (G418), resistencia a higromicina, resistencia a metotrexato, etc.).

Por último, se han desarrollado vectores de cromosomas artificiales para su uso en levaduras (YAC) y se están desarrollando para su uso en células de mamíferos (MAC).
Estos vectores eucariotas contienen secuencias teloméricas (los cromosomas eucariotas son moléculas lineales, no circulares) y centrómeros para asegurar la segregación apropiada de los cromosomas artificiales, así como marcadores seleccionables. Estos sistemas de vectores pueden ganar importancia a medida que avanzamos hacia la manipulación del genoma eucariota.


Discusión

La expresión heteróloga de múltiples genes en células de mamíferos es una tecnología clave en la investigación biológica contemporánea. Desafortunadamente, todas las tecnologías disponibles adolecen de importantes deficiencias, como una eficacia de cotransfección poco fiable. Nuestro sistema MultiLabel es claramente superior a la tecnología disponible actualmente por varias razones. Se pueden ensamblar varios casetes de expresión de forma combinatoria porque el sistema es modular. Esta es una clara ventaja cuando es necesario probar combinaciones de proteínas o mutaciones de una proteína. Todas las células expresan el conjunto completo de genes transfectados. Por tanto, la población de células transfectadas es uniforme y no una mezcla de células que expresan solo una fracción de los genes transfectados, hecho que es especialmente importante en los ensayos bioquímicos. La inserción simultánea de varios genes en un genoma celular es posible en un solo paso, lo que requiere menos tiempo que la integración secuencial mediante múltiples transfecciones. Los niveles de expresión se pueden regular de forma independiente porque el sistema transcribe ARNm autónomos y no es policistrónico. El uso de elementos IRES a menudo conduce a una expresión impredecible de los genes adyacentes. Se pueden utilizar varias estrategias de clonación, incluidos métodos de alto rendimiento basados ​​en robótica, debido a la aplicación de sitios de clonación estandarizados. El ensamblaje de los casetes de expresión se basa en la recombinación y, por lo tanto, es independiente de las enzimas de restricción. Nuestro diseño también permite la rápida modificación de vectores aceptores y donantes, ampliando así el alcance de nuestra tecnología a la expresión viral oa diferentes sistemas de integración.

Nuestros resultados proporcionan evidencia por primera vez de que es posible utilizar este concepto de tecnología para realizar ensayos biológicos celulares con alta eficacia. Nuestros resultados demuestran claramente que el comportamiento de las células transfectadas no se ve afectado negativamente, que podemos reproducir estudios de tráfico intracelular previamente publicados y que las células transfectadas evidentemente todavía pueden proliferar. La mayoría de las películas de lapso de tiempo y los estudios de curso de tiempo típicamente muestran solo dos canales de color. En contraste, mostramos aquí un curso temporal de una célula transfectada transitoriamente con cuatro canales y una película de una línea celular con cinco canales. En conjunto, esto proporciona una evidencia convincente de que MultiLabel de hecho aborda y alivia los problemas técnicos que hasta ahora inhibían.

Anticipamos que una amplia gama de aplicaciones en biología celular se beneficiarán significativamente del sistema MultiLabel. En este estudio, utilizando marcadores fluorescentes, demostramos el rendimiento superior de MultiLabel en comparación con los sistemas de coexpresión convencionales. Al introducir etiquetas de purificación por afinidad, nuestro enfoque será de igual beneficio para los sistemas y las aplicaciones de biología estructural en células de mamíferos. Ampliamos considerablemente la caja de herramientas existente para la expresión de proteínas y complejos de proteínas, por ejemplo, en el contexto de aplicaciones en el desarrollo y detección de fármacos.


FABRICACIÓN DE VECTOR AAV & # 8211 Desafíos & # 038 Oportunidades en la fabricación de vectores AAV usados ​​en la entrega de tratamientos de terapia génica

Se han realizado avances significativos en el direccionamiento específico de los vectores de administración y la mayor eficacia terapéutica de dichos vectores para la administración de genes, lo que ha estimulado un gran interés en el desarrollo y la comercialización de productos terapéuticos centrados en las indicaciones de la terapia génica. En los últimos años, ha habido una gran cantidad de resultados clínicos positivos para productos basados ​​en terapia génica que abarcan amplias áreas terapéuticas, incluida la inmunoterapia de células T con CAR, la oncología y la medicina regenerativa basada en enfermedades monogenéticas. En términos de suministro de genes, los vectores virales han surgido como los vehículos preferidos de elección, utilizados en el 48% de los 483 ensayos de terapia génica en curso. 1

De los productos de terapia génica en desarrollo, los vectores basados ​​en el virus adenoasociado recombinante (AAV) son actualmente los más utilizados y muestran el mayor potencial de administración en las indicaciones de la terapia génica. 1-3 El primer ensayo clínico basado en el vector rAAV se realizó hace 20 años, un estudio de fase I que administra un transgén CTFR a través de un vector Raav a pacientes adultos con fibrosis quística con enfermedad del pulmón medio. 4 En 2015, se informó que se estaban desarrollando 103 productos basados ​​en vectores rAAV, un número que se espera que aumente aún más en los próximos años. 1 El uso preferido de los sistemas de vector rAAV se debe, en parte, a la falta de enfermedad asociada con el virus de tipo salvaje, la capacidad del VAA para transducir células que no se dividen y que se dividen, y el resultado de transgén robusto a largo plazo. expresión observada en varios ensayos de fase I / II. 5 Además, se pueden explotar diferentes serotipos de vector rAAV, ya sea de origen natural o híbrido / sintético, para dirigirse específicamente a diferentes tejidos, órganos y células, y ayudar a evadir cualquier inmunidad preexistente al vector, expandiendo así la aplicación terapéutica y comercial. potencial de las terapias génicas basadas en AAV. 6

Si bien la mayoría (74%) de los productos terapéuticos basados ​​en AAV se encuentran en fase de desarrollo clínico inicial o intermedia, una serie de resultados clínicos prometedores han ayudado a progresar en la línea de posibles productos basados ​​en AAV. En 2012, la empresa holandesa UniQure obtuvo la autorización de comercialización en Europa para Glybera®, una terapia génica basada en AAV1 para el tratamiento de pacientes adultos diagnosticados con deficiencia familiar de lipoproteína lipasa (LPLD). Los recientes éxitos clínicos de AAV y otras terapias génicas basadas en vectores virales han impulsado inversiones significativas en el sector, como tal, existe una creciente demanda de soluciones de producción de buenas prácticas de fabricación (GMP) de grado clínico para estos productos de vectores virales.

LA NATURALEZA DEL DESAFÍO

El desarrollo de procesos de fabricación de nuevos productos bioterapéuticos requiere mucho tiempo y es caro. La producción de vectores virales recombinantes se considera compleja, y la ampliación de la producción se considera un desafío importante desde el punto de vista técnico y una gran barrera para la comercialización.

Las dosis clínicas informadas para los vectores virales basados ​​en AAV varían de 1011 a 1014 partículas genómicas (genomas de vector vg) por paciente, dependiendo del área terapéutica. 1,3,6 Desde una perspectiva más amplia del desarrollo de la terapia génica, los enfoques actuales de escalamiento horizontal no llegan a suministrar la cantidad requerida de dosis para permitir el progreso de las etapas posteriores de la Fase (II / III), retardando así el desarrollo de productos de terapia génica. Esto está respaldado por el hecho de que la mayoría de los estudios clínicos han sido muy pequeños, realizados en & lt100 pacientes (y en algunos casos & lt10), utilizando procesos de transfección celular adherente que generan cantidades muy modestas de producto. Cuando se comparan las cantidades previstas de virus requeridas para el desarrollo de la fase posterior con las productividades actuales (aproximadamente 5 x 1011 vg de una fábrica de células de 10 capas), existe una preocupación real de que este enfoque no cubra los requisitos de material para la fase tardía y en el mercado. necesidades incluso para enfermedades ultrahuérfanas, que tienen altas dosis y pequeñas cohortes de pacientes, y mucho menos indicaciones de terapia génica más "estándar".

En el caso de AAV, existen varias estrategias de producción para generar vectores virales, ya que con todas las estrategias diferentes se asocian una serie de ventajas y desventajas con cada una.

LÍNEAS CELULARES ESTABLES PARA LA PRODUCCIÓN

La generación de líneas celulares modificadas por ingeniería estable, mediante la introducción de genes reguladores (Rep) y de la cápside estructural (Cap) y / o el genoma del rAAV, dan lugar a líneas celulares de empaquetamiento o productoras, respectivamente. Los vectores virales de AAV se producen a partir de líneas celulares de empaquetamiento tras la transfección de la construcción de AAV y la coinfección con un virus auxiliar, como el adenovirus (Ad) o el virus del herpes simple (HSV) o mediante una única infección con un vector viral auxiliar recombinante que contiene el genoma de rAAV. Para las líneas de células productoras, el VAA se genera después de una infección de un solo paso con un virus auxiliar Ad o HSV. Se ha informado que las líneas celulares estables producen partículas de genoma de vector (vg) de AAV relativamente altas por célula (hasta 10.000 vg por célula productora). Las líneas celulares de empaque y producción se han generado utilizando líneas celulares capaces de crecimiento tanto adherente como en suspensión, lo que permite el desarrollo de procesos que utilizan sistemas tradicionales de cultivo de tejidos a pequeña escala, combinados con una fabricación a gran escala realizada en biorreactores en suspensión. Este enfoque escalable se ha utilizado en la producción de un producto AAV1 para la insuficiencia cardíaca. En este caso, el vector viral se ha generado a una escala de 2000 L a partir de una línea celular productora de HeLaS3, tras la coinfección con virus auxiliares. 7

A pesar del rendimiento y la escalabilidad relativamente altos informados, una serie de desventajas han limitado el uso de las líneas celulares productoras y empacadoras en el desarrollo clínico. La generación de líneas estables es técnicamente exigente, requiere mucho tiempo y debe realizarse para cada combinación de vector y serotipo de AAV. La caracterización clonal y la estabilidad de la línea celular consume mucho tiempo y es costosa, y además conlleva un riesgo potencial basado en el historial de pases celulares y la relación entre la cinética de crecimiento y la producción de vectores. Una de las principales preocupaciones es el uso de variantes híbridas y de anuncios auxiliares en estos sistemas. La producción del virus auxiliar puede ser en sí misma extremadamente costosa y prolongada, con la necesidad de evaluar cuidadosamente la calidad de este material de partida crítico antes de su uso en la producción de AAV. Además, el establecimiento de procedimientos efectivos de eliminación y eliminación para separar el virus auxiliar del producto vector AAV no es trivial, lo que da como resultado un desarrollo de procesos posteriores complejo y costoso y un costo de los productos potencialmente alto.

SISTEMA DE PRODUCCIÓN DE BACULOVIRUS

La producción de vectores AAV utilizando un sistema de expresión de baculovirus (BV) surgió como consecuencia de la capacidad del sistema BV para producir proteínas recombinantes glicosiladas complejas a altos niveles en células de insectos SF9 a altas densidades celulares. Sobre la base de la producción de AAV a través de un sistema de línea celular estable, el sistema BV se desarrolló para producir un vector viral sin la necesidad de coinfectar con un virus auxiliar humano. El AAV2 se produjo en células de insecto Sf9 tras la coinfección con tres vectores BV recombinantes, que codifican los transgenes para el genoma Rep, Cap y rAAV, respectivamente. Desde entonces, el sistema BV se ha modificado y mejorado, y ahora se han desarrollado sistemas que utilizan un enfoque de dos vectores, lo que reduce la complejidad del proceso. También se han empleado soluciones escalables en un enfoque que utiliza células de insecto infectadas con BV criopreservadas que portan por separado los componentes de AAV requeridos (genoma de rAAV, genes Rep y Cap). Las células infectadas se utilizaron para inocular un biorreactor a escala de 200 l que contenía células de insectos sin modificar y liberaron rBV infeccioso (rAAV, rCAP, rRep) de manera continua que posteriormente infectó las células no infectadas, impulsando así una fase de producción sostenida. 8

Actualmente, el fármaco Glybera basado en AAV1 se produce utilizando el sistema BV, sin embargo, varios inconvenientes han limitado el uso del sistema BV para producir vectores AAV en el entorno clínico. Superar los aspectos de la biología celular molecular necesarios para producir un vector viral de mamífero en un sistema de células de insectos utilizando virus de insectos presenta importantes desafíos: se ha informado de la inestabilidad de los genes de AAV dentro de BV, junto con la incapacidad para ensamblar partículas de AAV con la estequiometría correcta de las proteínas de la cápside. que afecta a la infectividad del vector viral AAV producido. De manera similar a los sistemas de producción de líneas celulares estables, existen desafíos para eliminar y eliminar el BV inicial y propagado de los vectores virales AAV durante la operación de purificación posterior. Sin embargo, varias empresas biofarmacéuticas están utilizando actualmente variaciones de la plataforma BV y están trabajando activamente en mejoras para mitigar las limitaciones del sistema BV, avanzando hacia la fabricación clínica de rAAV a gran escala.

TRANSFECCIÓN TRANSITORIA SIN AYUDA

La transfección transitoria de ADN plasmídico en células de mamífero para la producción de vectores virales de AAV es la estrategia más comúnmente utilizada en la fabricación de grado clínico de estos vectores virales. Los vectores de rAAV se producen generalmente en células de riñón embrionario humano 293 (HEK293) o variantes de células HEK293 después de la introducción (transfección) de típicamente tres plásmidos de ADN que llevan los genes reguladores (Rep) y de la cápside estructural (Cap), el transgén de rAAV y el específico genes que proporcionan una función de anuncio auxiliar. Si los tres plásmidos se transfectan con éxito en una célula, la célula producirá un vector rAAV sin necesidad de coinfectar con el virus auxiliar de tipo salvaje. El enfoque de transfección es bastante rápido y versátil y se ha utilizado para producir diferentes serotipos de rAAV, ya que solo la secuencia genética de los genes Cap tiene que alterarse para producir los diversos serotipos. Además, la modificación del plásmido transgénico permite generar formas del vector tanto monocatenarias como bicatenarias (autocomplementarias).

Una vez más, el principal desafío de este enfoque es la falta inherente de escalabilidad debido al uso de células HEK293 adherentes.Como tal, los sistemas de células adherentes requieren un enfoque de escalamiento basado en la expansión lineal del área de superficie 2D, en lugar del enfoque volumétrico de escala 3D generalmente empleado en la producción de productos biofarmacéuticos. Con el fin de producir y purificar el número de partículas del genoma del vector (vg) requerido de & gt1 & # 2151016 vg para respaldar los ensayos clínicos de etapa media a avanzada, más de 500 Hyperstacks ™ (un Hyperstack tiene 36 capas y una superficie total de 18.000 cm 2) sería necesario. Si bien es posible, este enfoque no es una opción viable para la mayoría de las instalaciones de fabricación debido a las limitaciones de espacio, costo y mano de obra de la instalación. Se está trabajando para desarrollar soluciones de producción verdaderamente escalables y que cumplan con las normativas para la generación de vectores rAAV. Las células HEK293 se han adaptado para el crecimiento en suspensión en sistemas de medios sin componentes animales, sin suero y sin antibióticos, con la optimización de las condiciones de transfección evaluadas en sistemas de biorreactor de matraz de agitación, balanceo y tanque agitado.

PURIFICACIÓN DE VECTORES VIRALES CORRIENTE ABAJO

Independientemente de los procesos y escalas de producción de vectores, el objetivo final de la fabricación de vectores de AAV es tener una purificación posterior sólida que genere material clínico final que tenga un título alto, una potencia alta y una pureza alta. Debido a la naturaleza emergente del campo de los vectores virales, la mayoría de los enfoques posteriores se basan en procesos de laboratorio tradicionales que no son escalables ni adecuados para la fabricación de grado clínico. Existen limitaciones a lo largo de la purificación posterior de los vectores virales, que incluyen: la recolección de las células productoras, los procedimientos de lisis celular para liberar el vector AAV, la clarificación y eliminación de impurezas celulares, la separación y purificación del vector, y la formulación del vector y la filtración estéril.

El desafío se puede ejemplificar por la forma en que las partículas de vector que contienen genómico se han separado tradicionalmente de las partículas vacías usando ultracentrifugación en gradiente. Si bien el material resultante obtenido de tal paso es de alta pureza y alta potencia, la naturaleza lenta y la complejidad del aumento de escala limitan significativamente el uso de ultracentrifugación dentro del proceso posterior. Para indicaciones terapéuticas, distintas de las enfocadas a enfermedades ultrahuérfanas que requieren pequeños volúmenes de material para ser purificados, la necesidad de procesar grandes volúmenes requiere un método alternativo de purificación. Como tal, se están desarrollando enfoques basados ​​en cromatografía utilizando etapas de unión por afinidad y / o intercambio iónico que proporcionan eficiencia, flexibilidad y escalabilidad para la purificación de vectores AAV. Como se pueden generar vectores de alta pureza y alta potencia usando enfoques de ultracentrifugación, el desafío para un enfoque de purificación cromatográfica es generar vectores con el mismo grado de pureza y potencia. Por lo tanto, se debe dar consideración regulatoria a cualquier cambio de proceso durante el programa de desarrollo clínico. Además, debido a las variaciones químicas y biológicas observadas entre los diversos serotipos de AAV, el desarrollo de una única plataforma aguas abajo para todos los vectores de AAV puede ser poco probable, más bien es probable que se empleen varias soluciones potenciales.

SISTEMAS ANALÍTICOS PARA LA CARACTERIZACIÓN DE PRODUCTOS Y PROCESOS AMP

Se están realizando desarrollos para mejorar los procesos de fabricación clínica y pasar a sistemas de purificación y producción escalables y controlables. Sin embargo, estos se ven obstaculizados por la falta de conocimiento de procesamiento de los parámetros críticos en todas las etapas del proceso de fabricación, impulsado por la falta de sistemas analíticos adecuados para respaldar los estudios de desarrollo y para interrogar y controlar los procesos de producción, así como para caracterizar los materiales finales. 9 Vinculado al desafío de la fabricación está el requisito reglamentario para la identificación, caracterización y control de lote a lote de las impurezas relacionadas con el proceso y el producto presentes en el material altamente purificado. Especialmente desafiantes son las impurezas relacionadas con los productos del vector AAV, que se parecen mucho al vector en sí.

Las partículas de vector de AAV pueden empaquetar conjuntamente material plasmídico no específico en la cápside. Se ha informado que entre el 1% y el 8% de las partículas de AAV purificadas contienen una secuencia de ácido nucleico incorrecta. 7 Dado que los rangos de dosis clínica informados varían de 1011 a 1014 partículas genómicas, podría haber hasta 109 impurezas empaquetadas conjuntamente por dosis. Estas impurezas relacionadas con el proceso requieren una caracterización detallada, junto con una evaluación del potencial de que el ADN empaquetado incorrectamente sea activo en las células transducidas. 10

Curiosamente, la mayoría de los plásmidos que se utilizan actualmente para la transfección transitoria llevan un gen de resistencia a los antibióticos para permitir la selección y el mantenimiento del plásmido durante su propia producción. Por lo tanto, la eliminación de genes de resistencia a antibióticos sería deseable para la producción de VAA en sistemas sin ayuda. Existe tecnología, como el sistema patentado de mantenimiento de plásmidos Operator Repressor Titration (ORT ™) de Cobra, para generar ADN plasmídico que carece de genes de resistencia a los antibióticos. 11 Estos sistemas eliminan la posibilidad de empaquetar conjuntamente un gen funcional de resistencia a los antibióticos en la cápside viral, aumentando así la seguridad del producto y reduciendo la carga de caracterización de las impurezas relacionadas con el AAV.

VISIÓN DE UNA PLATAFORMA DE PRODUCCIÓN ESCALABLE BASADA EN EL CONOCIMIENTO

Sigue existiendo una clara necesidad de mejorar la productividad del proceso y la necesidad de desarrollar procesos de fabricación que se puedan aplicar a un gran número de candidatos terapéuticos de vectores virales basados ​​en AAV. De manera simplista, el vector AAV es un vehículo de administración de un gen terapéutico y el proceso de fabricación no está vinculado a ese gen. Por lo tanto, la lógica dicta que debería ser posible generar procesos de plataforma específicos para los serotipos de AAV e incluso posible generar procesos que se puedan aplicar a múltiples serotipos. Este enfoque tiene precedentes: el desarrollo de procesos de fabricación y desarrollo basados ​​en plataformas que desconecta la producción de productos específicos ha tenido un impacto enorme en otras áreas biológicas (es decir, anticuerpos monoclonales), reduciendo el costo de desarrollo, los plazos y el costo de los bienes, y ha también permitió a los desarrolladores de medicamentos expandir significativamente los procesos clínicos en múltiples áreas terapéuticas.

Para lograr esto para los vectores AAV, es necesario generar y optimizar el conocimiento científico subyacente en torno a los parámetros operativos críticos en el proceso de fabricación, junto con un conjunto de métodos analíticos estándar. Cualquier plataforma desarrollada deberá ser lo suficientemente flexible para adaptarse a múltiples tipos de vectores AAV. Dicho desarrollo tendrá beneficios a largo plazo para la generación de materiales para los primeros estudios en el hombre y en adelante para los estudios clínicos en etapa tardía y, en última instancia, para el suministro en el mercado.

1. Mercado de terapia génica 2015-2025, Informe de análisis de raíces (2015).
2. Ginn SL, Alexander IE, Edelstein ML, Abedi MR, Wixon J. Ensayos clínicos de terapia génica en todo el mundo hasta 2012: una actualización. J Gene Med. 201315: 65-77.
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11. Cranenburgh. Et al. Ácidos nucleicos Res. 200129: e26.

Para ver este número y todos los números anteriores en línea, visite www.drug-dev.com.

Dr. Daniel C. Smith es Director Científico de Cobra Biologics y tiene la responsabilidad de desarrollar el más alto nivel de excelencia científica en todo el Grupo y mejorar las plataformas de investigación y desarrollo de ADN, virus, microbios y proteínas de mamíferos de Cobra. Antes de unirse a Cobra, pasó 4 años con el equipo de bioProcessUK en HealthTech & amp Medicines Knowledge Transfer Network (KTN), impulsando la agenda de innovación para el bioprocesamiento biológico en el Reino Unido como Gerente de Transferencia de Conocimiento. El Dr. Smith adquirió su experiencia industrial en Cobra en una variedad de roles que progresaron desde Científico Senior hasta Gerente de Desarrollo Científico Comercial, responsable de desarrollar la estrategia para los proyectos del cliente, junto con el mantenimiento de la supervisión científica de los proyectos de I + D + i de Cobra. Obtuvo su BSc (Hons) en Bioquímica y su Doctorado en Biología Celular Molecular. Tiene más de 20 publicaciones de investigación en su haber trabajado con varios grupos académicos en el Reino Unido, Europa y los EE. UU. Y tiene una amplia experiencia en investigación académica en biología celular, biología molecular, inmunología y bioquímica de proteínas, con una experiencia particular. en toxinas basadas en proteínas y vectores de liberación celular.


Transfiriendo el gen

A vector es un molécula de ADN portador en el que se puede insertar el gen deseado.

Más comúnmente, este vector es un plásmido. Se trata de una pequeña pieza circular de ADN extracromosómica que a menudo se encuentra en las bacterias además de su ADN funcional.

Los plásmidos se modifican para que tengan dos o más genes para resistencia a los antibióticos. También deben contener una secuencia que pueda ser reconocida por la misma enzima de restricción utilizada para cortar los fragmentos. El sitio que se corta debe estar en uno de los genes de resistencia a los antibióticos.

Un plásmido cortado por Bam HI:

Cómo se introduce el gen en el plásmido:

Cortar el genoma con una enzima de restricción (RE) y mezclar con el plásmido que también se ha cortado con el mismo R.E para que los extremos pegajosos de los fragmentos y el plásmido sean complementarios. Con suerte, algunos fragmentos insertar en el ADN plasmídico antes de que cualquiera de los segmentos se una a sí mismo.

Los fragmentos se agregan a los plásmidos con estos posibles resultados:

  1. El plásmido vuelve a unirse, el gen de la tetraciclina ahora está intacto.
  2. El fragmento se une al plásmido. El gen de resistencia a la tetraciclina se interrumpe, el fragmento no contiene el gen deseado.
  3. El fragmento se une al plásmido. El gen de la tetraciclina se interrumpe, esta vez el fragmento contiene el gen deseado.
  4. El fragmento se une a sí mismo.

Algunos plásmidos ahora contendrán el ADN recombinante fragmento.

Sin embargo, otros plásmidos no contendrán un fragmento. Si los plásmidos son recombinantes, entonces uno de los genes de resistencia a los antibióticos (por ejemplo, para la tetraciclina) habrá sido interrumpido. Sin embargo, el otro gen de la resistencia a los antibióticos (por ejemplo, la ampicilina) seguirá intacto.

Todavía hay un problema: ¿cómo se identifica el plásmido recombinante con el gen deseado en él?

Aislar el gen deseado en la colonia correcta

Necesitas conocer el ADN secuencia de bases del gen de la proteína deseada de modo que una sección de esa secuencia de bases pueda ser etiquetado radiactivamente.

Esta sección de ADN con la secuencia de bases correcta se llama Investigacion.

El ADN de las bacterias es "descomprimido" de modo que se convierta en monocatenario y una sonda se hibriera (adhiera) si hubiera bases complementarias.

La sonda se agrega y se adhiere al fragmento complementario correcto. Ahora se puede identificar el fragmento correcto, ya que es radiactivo.

Todas las bacterias de una colonia se han producido mediante la replicación de un individuo. Por tanto, todos tendrán los mismos genes para producir las mismas proteínas. Esta colonia puede entonces ser aislado y multiplicado de modo que la proteína se sintetice y pueda recolectarse para su uso posterior.

Las bacterias pueden usarse de esta manera para producir insulina humana para los diabéticos que no producen la suya propia.


PCOR: un nuevo diseño de vectores plasmídicos para la terapia génica no viral

Se ha desarrollado un sistema host / vector totalmente rediseñado con propiedades mejoradas en términos de seguridad. Los plásmidos pCOR son vectores plásmidos de rango estrecho de huéspedes para la terapia génica no viral. Estos plásmidos contienen un origen de replicación condicional y deben propagarse en una cepa huésped de E. coli diseñada específicamente, lo que reduce en gran medida el potencial de propagación en el medio ambiente o en pacientes tratados. La columna vertebral pCOR tiene varias características que aumentan la seguridad en términos de diseminación y selección: (1) el origen de la replicación requiere una proteína iniciadora específica del plásmido, la proteína π, codificada por el gen pir que limita su rango de hospedadores a las cepas bacterianas que producen este trans. -proteína que actúa (2) el marcador seleccionable del plásmido no es un gen de resistencia a antibióticos sino un gen que codifica un ARNt supresor bacteriano. Se construyeron hospedadores de E. coli optimizados que soportan la replicación y selección de pCOR. Se obtuvieron altos rendimientos de monómeros pCOR superenrollados (100 mg / l) mediante fermentación por lotes alimentados. Los vectores pCOR que llevan el gen indicador de luciferasa dieron niveles elevados de actividad luciferasa cuando se inyectaron en el músculo esquelético murino.

En la terapia génica se utilizan dos tipos diferentes de vehículos de ADN, basados ​​en virus recombinantes y plásmidos de ADN bacteriano. Aunque los vectores basados ​​en virus se utilizan ampliamente y son vectores muy eficientes, los riesgos potenciales de la entrega de genes virales deben considerarse seriamente. E. coli Los vectores basados ​​en plásmidos son vehículos versátiles y no infecciosos para la terapia génica. La fabricación de ADN plasmídico terapéutico que lleva potentes genes humanos se convierte en una realidad. Por lo tanto, se deben desarrollar nuevos enfoques que tengan en cuenta la seguridad y la consideración medioambiental.

El diseño vectorial es un factor importante que contribuye a la seguridad de la producción y la terapia. Los esfuerzos para mejorar la estructura del plásmido se han centrado en la mejora de la expresión del transgén1 o el número de copias del plásmido2, pero no se ha informado de un diseño racional en términos de diseminación o tamaño. Los plásmidos bacterianos derivados de ColE1 se utilizan actualmente en experimentos de terapia génica y ensayos clínicos. En cuanto a la seguridad y la contención de dicho material genético, dos elementos son perjudiciales: el origen de replicación de ColE1 y el marcador de resistencia a antibióticos. El uso clínico de tales plásmidos podría potencialmente conducir a su diseminación en el medio ambiente o en el paciente. Esto podría ser de suma importancia para los inmunodeprimidos o para los pacientes con fibrosis quística que padecen infecciones broncopulmonares crónicas.3 Los plásmidos pCOR, para plásmidos con origen condicional de replicación, fueron diseñados y desarrollados específicamente para terapia génica. Estos nuevos plásmidos son pequeños portadores de transgenes eficientes y cumplen varios criterios de garantía de calidad y seguridad.4 Estos plásmidos de alto número de copias contienen una cantidad mínima de secuencias bacterianas, un origen de replicación condicional que evita la diseminación durante la producción o la terapia y no contienen resistencia a los antibióticos. gene.

La columna vertebral pCOR consta de tres elementos bacterianos: el origen de replicación condicional de R6K γ de 0,4 kb (ori γ), que requiere que la proteína iniciadora R6K π sea funcional, un gen supresor de tRNA seleccionable de 0,2 kb (sorber Phe) y un 0,4 kb cer (Resolución ColE1) para resolver oligómeros pCOR.

Dichos plásmidos solo pueden replicarse en bacterias productoras de π, lo que limita considerablemente su rango de hospedadores. La selección de pCOR utiliza la expresión de un gen de ARNt supresor de ámbar sintético, específico para fenilalanina (sorber Phe), que no requiere antibióticos. Este supresor corrige una mutación ámbar en argE gen que hace posible que la cepa huésped recombinante crezca en un medio mínimo que carece de arginina (Figura 1).

Sistema de vector huésped pCOR. La cepa XAC-1pir116 requiere arginina para su crecimiento en un medio mínimo, mientras que la deficiencia de arginina del huésped pCOR se corrige mediante el ARNt sup Phe del plásmido. El plásmido pCOR, pir116 y argEsoy genes, y el cromosoma XAC-1pir116 no están dibujados a escala. La mutación ámbar se muestra con un stop y su corrección con un stop tachado. Genotipo XAC-1pir116: ara Δ (lac-proB)x111 gyrA argEsoy rpoB thi uidA (ΔMluI) :: pir116 F ′ (proB + lacI373 lacZu118am).

El origen de replicación condicional de pCOR proviene de un plásmido natural, R6K, en lugar de los plásmidos derivados de ColE1 ampliamente utilizados. R6K es un plásmido R (resistencia) de replicación theta de 38 kb. Las funciones de replicación de R6K5 se agrupan en un fragmento de ADN de 5,5 kb que contiene tres orígenes de replicación: α y β que se utilizan principalmente, y γ. Los tres están bajo el control de una única proteína de iniciación de la replicación, π, el producto de la pir gene. Esta proteína se une a las repeticiones directas de la secuencia de nucleótidos (siete repeticiones directas de 22 pb asociadas en tándem) en el origen de la replicación. Es un regulador dual, que ejerce un efecto positivo sobre la replicación y una retroalimentación negativa que mantiene a R6K en su número de copias característico (15 por genoma). Los mutantes copiados inhiben menos la replicación y mantienen el origen γ en un alto número de copias.pir116 6 contiene una mutación de una sola base (CCC → CTC) que conduce a una sustitución de prolina por leucina en la posición 106 en π.

La información genética mínima requerida para mantener los derivados de R6K es el origen γ de 400 pb (ori γ) y el cis o trans-actuando la proteína iniciadora π.5 Ori γ se aisló del vector suicida pUT-T7pol7 como un 0,4 kb BamHOLA-EcoRI y se ligó al gen de resistencia a la kanamicina (Km R) de pUC4K8 para generar pXL2666. La replicación de Ori γ y el número de copias del plásmido se ensayaron en fondos de tipo salvaje y copia. pXL2666 se transfirió a un pir (BW190949) y un pir116 cepa (BW196109) de E. coli. La electroforesis en gel de agarosa mostró que había de cinco a 10 copias más de ADN plasmídico en el pir116 que en el pir cepa, consistente con trabajos previos6 (datos no mostrados). También señaló que la relación monómero / oligómero de los derivados de R6K se vio afectada por la presencia de la mutación copy-up que dio como resultado que las principales especies de plásmidos fueran multímeros, en su mayoría dímeros (Figura 2). Linealización de plásmidos por EcoRI indicó que estas preparaciones contenían una mezcla de monómero y los oligómeros correspondientes. El tratamiento con topoisomerasa mostró que las especies de alto peso molecular eran multímeros plásmidos circulares, superenrollados, en lugar de catenanos. Estos plásmidos se relajan por la ADN topoisomerasa I y la topoisomerasa IV10 y no se observó decantación por la topoisomerasa IV, aunque esta enzima era activa en el ADN del cinetoplasto (datos no mostrados). La multimerización de plásmidos no es compatible con el uso farmacéutico debido a la baja reproducibilidad de lote a lote y muy pocas moléculas por unidad de peso. Además de reducir el número de moléculas segregantes independientes, también puede reducir gravemente la estabilidad del plásmido al afectar la segregación del plásmido durante la división celular bacteriana. En nuestro esfuerzo por resolver multímeros, probamos el cer fragmento que puede promover la monomerización independientemente del replicón involucrado. Esta cisEl determinante de ADN que actúa reduce la multimerización a través de un evento de recombinación específico del sitio que solo requiere E. coli-Proteínas codificadas. Son necesarias dos recombinasas, XerC y XerD, junto con dos proteínas accesorias, ArgR y PepA, que aseguran exclusivamente la recombinación intramolecular en el cer sitio.11 El 0.38 kb HpaII cer fragment12 del E. coli El plásmido ColE1 se insertó en pXL2666. Comparación de pXL2666 (ori γ-Km R) y pXL2730 (ori γ-Km R -cer) topología (Figura 2) mostró que cer conduce a la monomerización de plásmidos derivados de R6K. Una deleción12 que conduce a la inactivación de cer, se introdujo en pXL2666 para generar pXL2754 (ori γ-Km R -Δcer). Esta construcción condujo a la producción de plásmidos multímeros. Estos experimentos también se llevaron a cabo en XAC-1pir y XAC-1pir116 cepas (datos no mostrados) que difieren sólo por el pir alelo. Por lo tanto, estos resultados arrojan luz sobre el vínculo entre la multimerización / copia de plásmidos pir mutaciones y resolución de multímeros a través de cerrecombinación intramolecular mediada.

Influencia de cer en la topología de plásmidos derivados de R6K. (a) Construcciones de plásmidos. B: BamHI E: EcoRI M: Sitios de restricción MluI. (b) Análisis en gel de agarosa de la topología del plásmido. Los plásmidos se prepararon mediante gradiente de CsCl-bromuro de etidio y se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. 1, pXL2666 2, pXL2754 3, pXL2730. a, plásmido lineal (digerido con EcoRI) b, plásmido circular.

Una característica original importante de pCOR es la ausencia de un gen de resistencia a antibióticos para la selección en E. coli. E. coli Los genes de ARNt supresores de ámbar (TAG) no contienen ninguna secuencia derivada de fagos o transposones y son muy pequeños (menos de 100 pb). Son marcadores de selección de plásmidos eficientes, incluso en cultivos de alta densidad de E. coli.13 Un gen tRNA supresor de ámbar sintético, específico para fenilalanina (sorber Phe) se utilizó como marcador pCOR. sorber Phe se expresa a partir de un fuerte componente constitutivo E. coli promotor, Plpp. Este casete (0,17 kb NarI-HindIII) se aisló de pCT2-F14 y se probó en E. coli XAC-1.14 El cromosómico argE El gen de XAC-1 contiene una mutación ámbar que da como resultado un producto truncado y, por lo tanto, inactivo. Como argE codifica N-acetilornitinasa que es esencial para la biosíntesis de arginina, esta cepa no puede crecer en ausencia de arginina. El ARNt supresor sorber La Phe provoca la traducción correcta del ARNm y la síntesis de una N-acetilornitinasa activa de longitud completa. Por tanto, XAC-1 puede crecer en un medio mínimo que carece de arginina siempre que el plásmido esté presente, lo que garantiza la selección del plásmido. Sin embargo, esta cepa no sintetiza la proteína iniciadora R6K π y, por tanto, no puede replicar pCOR. Por lo tanto, el gen que codifica π, pir (o el mutante de copia pir116), se insertó en el cromosoma XAC-1 mediante recombinación homóloga. Este método no introduce ningún elemento genético móvil, como transposones o fagos, que afecten a la estabilidad del genoma. Dado que no hay similitud entre pir y el genoma bacteriano, pir o pir116 fueron insertados en el cromosoma uidA gen que codifica la β-D -glucuronidasa (EC 3.2.1.31), como lo describe Metcalf et al.9 Este gen proporciona suficiente similitud de secuencia con el E. coli genoma para que se produzca la recombinación. Los β-glucurónidos no son esenciales en condiciones de crecimiento estándar, por lo que es posible inactivar uidA por reemplazo con el gen de interés (pir o pir116). Reemplazo del genómico uidA gen con el uidA::pir116 casete que da como resultado uidA inactivación, es fácil de detectar con un sustrato cromogénico, X-gluc, ya que las colonias positivas para β-glucuronidasa desarrollan un color azul. El Km R -uidA:: pir116 cassette9 de M13wm33 (o pir de M13wm34) se insertó en el BamSitio HI de la forma replicativa M13mp1015. Este bacteriófago recombinante es un vector suicida en no supresores E. coli son. La técnica de reemplazo de genes desarrollada por Blum et al16 tuvo éxito en el 18-34% de los segregantes resistentes al desoxicolato y sensibles a la kanamicina, como lo demuestra la pérdida de actividad de la β-glucuronidasa. Estos clones se ensayaron evaluando la replicación de un derivado de R6K, pBW30.9. La integridad del genoma bacteriano en la región cercana al sitio de recombinación homóloga se analizó mediante PCR. Cada fragmento amplificado único, todos los cuales tenían el tamaño esperado, se identificó mediante análisis de restricción. Los otros marcadores genéticos argEsoy, lacZsoy, gyrA (resistencia al ácido nalidíxico), rpoB (resistencia a la rifampicina), la presencia de episoma F ′ (susceptibilidad a la infección por M13), no se vieron afectadas. Las cepas hospedadoras pCOR resultantes se denominaron XAC-1pir y XAC-1pir116. Un plásmido pCOR (pXL2760: ori γ-Km R -cer-sorber Se introdujo Phe) en estas cepas y la selección posterior mediante placa en medio mínimo demostró que estas dos cepas permiten la replicación y selección de pCOR. El rendimiento de pCOR de un cultivo a pequeña escala de XAC-1pir116 La cepa recombinante fue similar a la de los plásmidos estándar tales como pUC y se encontró que el patrón de análisis de restricción se ajustaba a la teoría (datos no mostrados).

Dado que la degradación del ADN plasmídico podría ocurrir durante el proceso de producción / purificación, se construyó un hospedador pCOR que carece de endonucleasa I. Endonucleasa I, codificada por endA, es una DNasa periplásmica que es inhibida por el ARN y escinde internamente el ADN nativo en oligodesoxirribonucleótidos de una manera independiente de la secuencia.17 Esta enzima no es esencial y su papel biológico en E. coli aún se desconoce ya que los mutantes se asemejan a las células de tipo salvaje en términos de tasa de crecimiento, propagación de fagos y propiedades de conjugación.18 Varios estudios19,20 han encontrado que las cepas EndA - producen ADN de mayor calidad que EndA + E. coli son. Un fragmento de ADN que contiene endA21 se utilizó para construir un vector suicida M13 KmR. El 0.37 kb FspI-PvuII fragmento central se eliminó eliminando el 52% de endA. Reemplazo genético del tipo salvaje endA por el eliminado endA Luego se obtuvo como se describió anteriormente para la construcción de XAC-1pir116. La modificación genómica del locus se verificó mediante PCR y la ausencia de actividad de endonucleasa I se demostró mediante dos pruebas bioquímicas. En primer lugar, se controló el reemplazo de genes mediante un ensayo de tinción con verde de metilo.17 En segundo lugar, se evaluó la ausencia de actividad endonucleasa utilizando la rotura del ADN superenrollado en presencia de líquido de choque frío22 de cepas mutantes o de tipo salvaje. El ADN plasmídico se degradó totalmente con un extracto de XAC-1pir116 (Cepa EndA +) mientras que no se observó degradación con la cepa isogénica EndA - (XAC-1pir116 endA − ).

XAC-1pir116 contiene un episoma F ', una molécula de ADN circular de aproximadamente 100 kb, que lleva proB + lacI373 lacZu118am. Muchos hombres E. coli cepas de laboratorio llevan un traD36 mutación en su episoma, pero no se ha descrito ninguna mutación que afecte a la capacidad de transferencia de F 'para XAC-1. traD está en el extremo 5 ′ de uno de los tra (transferencia) operones y codifica una proteína de membrana que está directamente involucrada en la transferencia del ADN y el metabolismo del ADN23, además, traD mutantes no transfieren el ADN.24 La presencia de traD puede considerarse como un riesgo potencial de diseminación del plásmido entre E. coli cepas por transferencia inespecífica de plásmidos co-residentes.25 Por lo tanto, el episoma traD gen de XAC-1pir116 se inactivó para abolir la transferencia de F '. Un fragmento central de 2 kb de traD, que comprende el 92% del gen, fue reemplazado con el elemento omega de 2 kb de pHP45Ω26 mediante recombinación homóloga en XAC-1pir116 endA -. El elemento omega contiene el aadA Gen de resistencia a antibióticos flanqueado por repeticiones cortas invertidas. aadA codifica aminoglucósido-3 adeniltransferasa y confiere resistencia a estreptomicina y espectinomicina. Se utilizó el fragmento omega porque termina prematuramente la síntesis de ARN y proteínas, lo que lleva a la inactivación de la totalidad. traD operón, no como marcador seleccionable (no se agrega antibiótico durante la producción del plásmido). PCR y análisis de restricción del modificado traD el locus mostró el patrón esperado de fragmentos amplificados demostrando que se había producido el reemplazo de genes. La cepa resultante se denominó TEX1. Se está evaluando esta nueva cepa huésped pCOR, que es más adecuada para aplicaciones industriales.

Dado que las aplicaciones de terapia génica requieren grandes cantidades de ADN plasmídico, evaluamos la cepa huésped pCOR en experimentos de fermentación. Se utilizaron medios complejos que contenían extracto de levadura para la fermentación por lotes alimentados con XAC-1pir116. La estabilidad de pCOR (más de 50 generaciones) hace posible el uso de tales medios no selectivos. En estas condiciones, XAC-1pir116 produjo más de 40 g / l de peso celular seco y se pudieron obtener 100 mg / l de pCOR pXL2774 (descrito en la Figura 3) a partir de fermentadores de 2 litros (Tabla 1). El número de copias de pCOR se evaluó en 400-500 plásmidos por célula y la tasa de síntesis de ADN plasmídico fue constante durante la fermentación. Estos resultados se extrapolaron a un fermentador de 800 litros adecuado para la fabricación (Tabla 1). Para controlar aún más las condiciones de cultivo, también se realizó la fermentación en ausencia de extracto de levadura o cualquier materia prima de origen animal. Se obtuvieron resultados similares (30 g / l de peso celular seco y 100 mg / l de ADN plasmídico) utilizando un medio definido en cultivos de 2 litros sin pérdida de productividad (Tabla 1).

Transfección in vivo con pCOR - Comparación de vectores de luciferasa después de la inyección en músculo de ratón. Los músculos tibial anterior de ratones se inyectaron por vía percutánea con 30 μl de ADN en solución salina que contenía 3 × 10 12 Casetes de expresión de luciferasa (aproximadamente 15 μg de ADN desnudo). Los ratones se sacrificaron 72 h después de la inyección. Los músculos se recogieron y se transfirieron a la solución de lisis del sistema de ensayo de luciferasa (Promega, Madison, WI, EE. UU.). La extracción se realizó además de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad luciferasa se midió usando un luminómetro LUMAT LB9501 (Berthold, Evry, Francia). Los resultados se indican como nanogramos (ng) de luciferasa por músculo inyectado como media ± error estándar de la media. El ADN plasmídico se purificó mediante ultracentrifugación en gradiente de CsCl-bromuro de etidio y se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa. El nivel de endotoxinas osciló entre 1 y 5 UE / mg de ADN plasmídico. Se indican los principales elementos estructurales de los vectores plásmidos. El nombre de los plásmidos pCOR está subrayado. CMV, citomegalovirus humano inmediato-temprano1 potenciador / promotor SV40, virus simio 40 promotor líder TK, secuencia líder del gen HSV1 TK luc, gen luciferasa peroxisomal luc +, gen de luciferasa modificado (citoplasmático) SV40 tardío / temprano, virus simio 40 (SV40) tardío / señal de poliadenilación temprana bGH, señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino.

transferencia del gen pCOR in vitro y en vivo fue evaluado y comparado con plásmidos comerciales. Se construyeron varios plásmidos pCOR con luc, el gen que codifica la luciferasa de luciérnaga, o luc+, el gen de la luciferasa citoplásmico diseñado. Estos plásmidos fueron eficientes en estándar in vitro transfección de líneas celulares murinas o humanas, dando niveles más altos de actividad del gen indicador que los plásmidos comerciales (es decir, pGL3 básico Promega, Madison, WI, EE.UU.) (datos no mostrados). La misma cantidad de casete de expresión de luciferasa (3 × 10 12) en los plásmidos pGL3-control, pXL2774 y pXL3133 dio 0,07, 0,4 y 16,5 ng de luciferasa por músculo (norte = 24), respectivamente, cuando se inyecta en el tibial anterior de ratones OF1, según se determina 72 h después de la inyección (Figura 3). Por tanto, el plásmido pCOR pXL3133 con un casete de expresión de luciferasa mejorado es eficaz para impulsar la expresión en el músculo con niveles de actividad del gen indicador al menos 200 veces más altos que los de un vector comercial de referencia. Este resultado fue comparable con los descritos previamente con plásmidos informadores optimizados de luciferasa derivados de ColE1.

La terapia génica no viral se ha basado exclusivamente en E. coli plásmidos derivados del plásmido ancestral ColE1. Estos plásmidos se replican en ausencia de proteínas codificadas por plásmidos y su mantenimiento solo requiere E. coli factores codificados por el huésped, como las ADN polimerasas I y III y la ARN polimerasa dependiente de ADN. Para restringir el rango de hospedadores de plásmidos a un solo E. coli cepa, diseñamos un plásmido derivado de un E. coli plásmido natural de rango estrecho de hospedadores, 28 R6K. A diferencia de la replicación de ColE1, R6K requiere la síntesis de la proteína π codificada por el plásmido que controla la replicación de R6K a través de las secuencias centrales de ori γ. La replicación de pCOR está restringida a un huésped bacteriano específico que expresa π. El origen γ de R6K no tiene un marco de lectura abierto identificado, no tiene secuencias indeseables, como secuencias de inserción, y ningún elemento que pueda dirigir su transferencia a otras bacterias. Aunque R6K contiene dos orígenes de transferencia, 29 no están presentes en el origen de replicación γ. La transferencia del episoma F 'del hospedador bacteriano se abolió mediante la inactivación insercional del episoma traD para evitar la co-transferencia ilegítima de baja eficiencia de pCOR.

Los hospedadores bacterianos pCOR, XAC-1pir116 o derivados como TEX1, están diseñados específicamente E. coli cepas que contienen una copia cromosómica de una variante de copia de pir, pir116, insertado en lo no esencial uidA gene. Los derivados de R6K tienen un número de copias bajo (alrededor de 15 copias por genoma) que no es compatible con la producción a escala industrial. Introducción de pir116 en el genoma XAC-1 genera un alto número de copias pCOR donde la multimerización del plásmido se resolvió insertando el cer sitio de resolución en pCOR. Este es el primer informe de plásmidos multímeros en pir116 cepas y de cerresolución multimer mediada. Clonamos con éxito inserciones de 8 kb en el esqueleto de pCOR sin ningún efecto sobre el número de copias del plásmido o la estabilidad, lo que indica que los derivados de pCOR o ColE1 parecían tener una capacidad de clonación similar. Las derivadas R6K pueden acomodar inserciones de hasta 50-100 kb en un contexto de copia.

Los plásmidos portadores de origen R6K γ se utilizan ampliamente como vectores suicidas en diversas bacterias, como E. coli (cepas no patógenas9 o patógenas31), Yersinia pestis,32 Pasteurella,33 Rhodobacter spheroides,34 Pseudomonas putida o Klebsiella pneumoniae.7 Esto apoya firmemente el hecho de que la replicación de pCOR depende totalmente de la proteína iniciadora π y, por lo tanto, es biológicamente segura. La replicación de R6K natural, que codifica π, está restringida a E. coli y bacterias estrechamente relacionadas.28 Hasta donde sabemos, no existe ningún informe de una actividad similar a π que pueda permitir la replicación de derivados de R6K. El riesgo potencial de diseminación de pCOR estaría restringido a una bacteria que contenga un R6K residente. Sin embargo, la incompatibilidad35 entre plásmidos que comparten el factor de incompatibilidad principal36 presente en ori γ conducirá a la pérdida de uno de estos plásmidos y, en cualquier caso, resultará en una replicación efímera de pCOR ya que no existe una ventaja selectiva para que las bacterias mantengan un pCOR. La replicación de pCOR es condicional y ofrece ventajas ambientales sobre los plásmidos actuales utilizados en terapia génica.

Los plásmidos se mantienen como moléculas de ADN extracromosómico estables y son excelentes vectores para la diseminación de genes de resistencia a antibióticos37 a una amplia gama de bacterias. La contaminación del producto final destinado a la terapia génica con un antibiótico podría provocar reacciones alérgicas. El uso de un ARNt supresor como marcador seleccionable en bacterias es, por tanto, una alternativa interesante a los marcadores de resistencia a los fármacos comúnmente utilizados. Este ARNt, para el que se mutó el anticodón para coincidir con el triplete de terminación ámbar, media la selección del plásmido en bacterias mediante la supresión de una mutación ámbar en un gen esencial para el crecimiento en las condiciones utilizadas. Este sistema desarrollado por Normanly et al14 demostró ser eficaz incluso en experimentos de fermentación.13 Un ARNt supresor de color ámbar puede provocar una lectura a través de un número significativo de codones de terminación naturales e inducir la síntesis de proteínas anormales. Sin embargo, esto requiere la conjunción de varios eventos en mamíferos: (1) transcripción suficiente del ARNt supresor en células de mamíferos (2) plegamiento correcto de este ARNt que es esencial para su actividad (3) reconocimiento correcto y (4) carga de un ARNt ARNt procariota específico por una sintetasa de ARNt eucariota. Varios experimentos sugieren que esto es poco probable. Jacobson38 no obtuvo aminoacilación de E. coli ARNt de tipo salvaje Phe con extractos de hígado de rata, hígado de ratón, maíz o bazo humano. También se ha demostrado que incluso si un E. coli ARNt supresor Gln se expresa en células de mamíferos, la supresión ámbar depende de la coexpresión del E. coli Gen de la aminoacil-tRNA sintetasa de GlnRS39 Expresión de sorber Phe solo puede resultar de señales de expresión eucariotas crípticas desconocidas en la cadena principal del plásmido. Para evitar la transcripción falsa, el casete de expresión eucariota se insertó en pCOR de manera que el transgén y sorber El gen Phe está en orientaciones opuestas.

La supresión del ámbar nunca es completa y la mayoría de los genes de mamíferos conocidos (79% 40) terminan en UAA o UGA. De acuerdo con estas observaciones, el ARNt supresor ámbar natural de mamíferos se aisló de hígado de ternera.41 No detectamos cambios aparentes en la viabilidad celular cuando se transfectaron pCOR en líneas celulares murinas o humanas. in vitro o en células musculares murinas en vivo. Además, cuando se expresan ARNt supresor ámbar eucariota a partir de señales de expresión eucariotas apropiadas, no se notan efectos adversos en células de mamíferos transfectadas42,43 o en plantas completas.44 Por tanto, es poco probable que el ARNt supresor bacteriano Phe cause efectos nocivos en células humanas y es un marcador seleccionable eficiente para pCOR en E. coli.

Se ha demostrado que las secuencias inmunoestimuladoras (ISS) cortas (6 pb) en el ADN plasmídico bacteriano desencadenan respuestas inmunes potentes y afectan la expresión génica en ratones45. Schwartz et al46 encontraron que los motivos CpG no metilados causaban inflamación del tracto respiratorio inferior de ratones que recibieron ADN por instilación intratraqueal. Los resultados obtenidos con oligonucleótidos47 dieron indicios del potencial de la ISS para estimular las células B humanas, pero los efectos en el hombre de la ISS plasmídica aún deben investigarse. Sin embargo, los resultados obtenidos en ratones sugieren que estas secuencias también pueden causar problemas en humanos.La columna vertebral de pCOR no contiene ISS. Además, no hay "dos 5" purinas - CpG no metilado - dos motivos 3 "pirimidina" en la columna vertebral de pCOR. Por el contrario, un plásmido que contiene el gen de resistencia a la kanamicina Tn903 ampliamente utilizado de pUC4K (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia), por ejemplo, VR1255,27 y el origen de replicación derivado de ColE1 de pBlueScript (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU.) Contiene nueve de esos motivos. Por tanto, pCOR debería tener menos propiedades inmunoestimuladoras, si es que las tiene, que los plásmidos estándar derivados de ColE1. Si se contempla la vacunación con ADN, podrían añadirse secuencias inmunoestimuladoras al esqueleto del plásmido.

La cadena principal de pCOR es significativamente más pequeña (1 kb) que los plásmidos estándar derivados de ColE1 (2,5 kb). Contiene un número mínimo de secuencias de ADN procariotas, cuyas funciones son conocidas. La reducción de la cantidad de secuencias procarióticas en los vectores plasmídicos es de importancia ya que algunas de estas secuencias fueron mostradas en diferentes estudios27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40 , 41,42,43,44,45,46,47,48 para interferir con la expresión del gen eucariota.

Nuestro objetivo era mejorar la bioseguridad durante la producción de plásmidos y la terapia génica no viral rediseñando totalmente la estructura del plásmido. El plásmido pCOR y el sistema huésped son adecuados para aplicaciones clínicas e industriales en términos de seguridad (origen de replicación condicional, sin marcador antibiótico, secuencias plasmídicas mínimas, inactivación de la transferencia de episomas bacterianos) y expresión génica (al menos tan eficiente in vitro y en vivo como plásmidos estándar derivados de ColE1, tamaño más pequeño). Además, pCOR ha demostrado ser apropiado para producción (alto rendimiento: 100-150 mg / l en fermentadores, posibilidad de usar medios definidos) y purificación (tamaño pequeño, alto número de copias, eliminación de la actividad endonucleasa I del huésped).

En conclusión, pCOR es un vector de ADN apropiado para la entrega de genes que ofrece ventajas ambientales sobre los plásmidos actuales sin ninguna pérdida en la eficiencia de transferencia de genes.


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